摘要：本研究為了檢測(cè)慶大霉素在動(dòng)物組織中的殘留，制備了單克隆抗體(Mab)，并建立了敏感的間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(icCLEIA)。首先將慶大霉素與牛血清白蛋白結(jié)合作為免疫原，免疫BALB/c小鼠。然后采用雜交瘤技術(shù)制備抗慶大霉素單抗。最后，建立了對(duì)慶大霉素具有50%抑制濃度(IC₅₀)為0.067 ng/mL的icCLEIA。icCLEIA的檢測(cè)限為0.002 ng/mL。單抗與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性<0.01%。慶大霉素在豬肉和魚類樣品中的加樣回收率為80 ~ 101%，變異系數(shù)<6.4%。樣品采用UPLC-MS/MS檢測(cè)，以評(píng)估icCLEIA的可靠性。結(jié)果表明，制備的抗慶大霉素單抗可用于動(dòng)物組織中慶大霉素殘留的快速、便捷的免疫檢測(cè)。

【內(nèi)容介紹】

1、抗原的制備

采用碳二亞胺偶聯(lián)法合成法，將載體蛋白(BSA或OVA) 10 mg溶解于2ml PBS (0.01 M, pH 7.4)中，然后加入EDC (6 mg)和NHS (10 mg)，在25°C下溫和攪拌0.5 h，然后將溶解于1ml PBS中的慶大霉素(10 mg)滴入上述溶液中。在25℃下攪拌3小時(shí)，在0.01 M PBS (pH 7.4)下透析3天。然后將溶液分裝并儲(chǔ)存在－20℃;采用BSA -慶大霉素偶聯(lián)物免疫，OVA -慶大霉素包被抗原。最后，用金免疫層析法(GICA)對(duì)兩種偶聯(lián)物進(jìn)行表征，以確定慶大霉素是否成功偶聯(lián)到BSA和OVA載體蛋白上。

2、慶大霉素單克隆抗體的制備

第一次免疫時(shí)，在FCA中乳化BSA -慶大霉素，7只8周齡BALB/c雌性小鼠(每只小鼠)皮下多點(diǎn)免疫，劑量為150µg。4周后，每3周給小鼠注射50µg乳化液中的BSA -慶大霉素，直至第5次免疫。第三次強(qiáng)化免疫7天后，從小鼠尾部抽血獲得抗血清。通過(guò)間接ELISA檢測(cè)抗血清的抗體滴度，并通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)抗體選擇性。第四次免疫后，選擇血清稀釋度高且對(duì)慶大霉素檢測(cè)靈敏度高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)前4天，將100-200µg慶大霉素- BSA加入PBS (0.01 M, pH 7.4)腹腔注射。用聚乙二醇(PEG1450)將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。融合后，將融合后的細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在HAT培養(yǎng)基中增殖。在細(xì)胞融合后7-10天，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并通過(guò)極限稀釋法進(jìn)行亞克隆。

3、icCLEIA的發(fā)展與優(yōu)化

棋盤法檢測(cè)包被抗原濃度和抗慶大霉素單抗稀釋倍數(shù)。優(yōu)化免疫反應(yīng)時(shí)間、二抗稀釋度、二抗反應(yīng)時(shí)間和發(fā)光檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度。在優(yōu)化條件下對(duì)icCLEIA的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。x軸為慶大霉素濃度的對(duì)數(shù)，B/B₀ (B)為慶大霉素指示濃度下的平均RLU;B₀為慶大霉素零濃度時(shí)的平均RLU。按照B/B₀ - logC繪制慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)Origin8.5計(jì)算慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢出限(LOD)、IC₅₀和線性范圍(IC₂₀-IC₈₀)。結(jié)果如圖1所示。

圖1所示。不同工作條件對(duì)icCLEIA敏感性的影響(n = 3). A:競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)時(shí)間;B:二抗孵育時(shí)間;C:二抗稀釋倍數(shù);D: RLU值檢測(cè)時(shí)間。

4、交叉反應(yīng)性

圖2所示。慶大霉素icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線(n = 3)

圖3所示。抗慶大霉素單抗與慶大霉素類似物的交叉反應(yīng)性

5、icCLEIA的恢復(fù)及其與UPLC-MS/MS分析的相關(guān)性

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對(duì)本地市場(chǎng)的豬肉和魚類樣品進(jìn)行了陰性檢測(cè)。陰性樣品分別加入0、0.375、0.75、1.5 μg濃度的慶大霉素。由于豬肉和魚類樣品中含有多種蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，在樣品預(yù)處理時(shí)采用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，正己烷提取脂質(zhì)。樣品提取后，采用icCLEIA和UPLC-MS/MS對(duì)提取物進(jìn)行分析。為了減少樣品成分的潛在干擾，提取液在分析前用PBST適當(dāng)稀釋。在豬肉樣品中，icCLEIA法對(duì)慶大霉素的平均加樣回收率為81% ～ 101%，變異系數(shù)為3.7% ～ 6.4%;UPLC-MS/MS法對(duì)慶大霉素的平均加樣回收率為96% ～ 106%，變異系數(shù)為0.2% ～ 5.1%。在魚類樣品中，icCLEIA的平均回收率為80% ～ 100%，CV值為0.8% ～ 6.3%;UPLC-MS/MS的平均回收率為100% ～ 105%，CV值為0.8% ～ 3.2%。結(jié)果表明，該方法可作為動(dòng)物食品中慶大霉素殘留快速、高效的篩選方法。

【結(jié)論】

本研究將慶大霉素半抗原與牛血清白蛋白(BSA)和卵細(xì)胞(OVA)結(jié)合制備免疫原和包被抗原，通過(guò)免疫小鼠和細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)獲得了幾個(gè)高親和力的抗慶大霉素陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。以特異性雜交瘤陽(yáng)性細(xì)胞40H6為原料制備腹水單克隆抗體，經(jīng)親和層析純化。以純化腹水單抗為基礎(chǔ)，建立了用于慶大霉素動(dòng)物組織檢測(cè)的高靈敏度icCLEIA, IC₅₀為0.067 ng/mL, LOD為0.002 ng/mL，與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性<0.01%。慶大霉素在豬肉和魚類樣品中的回收率為80 ～ 101%，變異系數(shù)小于6.4%。與以往報(bào)道的慶大霉素檢測(cè)方法相比，本研究開(kāi)發(fā)的icCLEIA具有更高的靈敏度和特異性。通過(guò)與UPLC-MS/MS的比較，驗(yàn)證了icCLEIA方法的可靠性和準(zhǔn)確性。因此，本研究建立的icCLEIA方法可作為常規(guī)篩選慶大霉素在動(dòng)物性食品中殘留的有力工具。