摘要：

　　基因工程技術(shù)可充分利用抗體天然結(jié)構(gòu)，徹底改變了免疫學(xué)。單鏈抗體(scFv)是基于重組抗體技術(shù)的典型生物制劑。scFv是通過短柔性肽linker將重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因連接成單個(gè)轉(zhuǎn)錄本，從細(xì)胞和合成文庫中生成的片段。scFv分子的特異性和親和力與親本抗體大多數(shù)情況下相當(dāng)。與標(biāo)記蛋白和其他分子融合可提高其穩(wěn)定性、循環(huán)半衰期、活性和純化效率。本文還介紹了包括scFv的構(gòu)建方案、治療和診斷應(yīng)用以及相關(guān)的挑戰(zhàn)。

　　1.引言

　　單克隆抗體(mAb)具有表位特異性，因此可以對它們進(jìn)行重組調(diào)整，以靶向參與潛在病理狀況的特定分子。這一特性使mAb在解決與其相關(guān)的治療和診斷限制方面，與多克隆抗體不同。此外，mAb可以通過嵌合或人源化雜交瘤制備，并且可以識別人類表位，克服了免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。人源化抗體已成功用于治療多種人類疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病和幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，mAb仍然不足以針對所有靶標(biāo)，因?yàn)槟承┛乖肿优c特定病理環(huán)境有關(guān)，具有非常隱蔽的性質(zhì)。此外，mAb對實(shí)體瘤的滲透及其瘤內(nèi)分布受到限制。這影響了它們在分子成像和治療領(lǐng)域的應(yīng)用效力。因此，研究人員開始尋找替代的抗體設(shè)計(jì)形式。重組抗體技術(shù)能夠生產(chǎn)具有不同修飾特征的抗體，對其他生物分子具有高親和力和特異性。

　　重組抗體片段是目前最熱門的研究領(lǐng)域，與全長mAb相比，重組抗體片段具有不同的特性。與傳統(tǒng)抗體相比，通過抗體工程、分子克隆甚至酶技術(shù)，可以更經(jīng)濟(jì)、更直接地生產(chǎn)片段分子。與以前的技術(shù)方案不同，這種新范式為新的治療學(xué)科創(chuàng)造了一個(gè)平臺，能夠靶向與特定病理疾病有關(guān)的分子。目前存在幾種抗體片段，最著名的是單鏈抗體(又稱單鏈可變片段，scFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體、抗原結(jié)合片段(Fab)和可結(jié)晶片段(Fc)結(jié)構(gòu)域。scFv Ab 包括可變重(VH)和可變輕(VL)鏈，具有較小的尺寸，可以從各種文庫中獲得。它可以被設(shè)計(jì)成更大的多聚體形式，如雙特異性、三價(jià)雙特異性、四價(jià)雙特異性抗體衍生物和偶聯(lián)形式，適用于多種應(yīng)用。本文討論了scFv的研究進(jìn)展和在治療和診斷中發(fā)揮的作用。

　　2.1. scFv的設(shè)計(jì)變體

　　scFv 由可變區(qū)(包括重鏈和輕鏈)的基因生產(chǎn)，這些基因通過短柔性linker肽在基因上構(gòu)建在單個(gè)轉(zhuǎn)錄本中(圖1a)。其通常能夠以與親本抗體相同的特異性和親和力結(jié)合靶抗原。其平均分子量為 27 kDa，被公認(rèn)為是具有 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域的所有抗體片段中最小的功能性免疫球蛋白單元。VH-linker-VL和VL-linker-VH排列都可以產(chǎn)生有用的scFv，但在某些情況下，scFv在一種構(gòu)象中的表現(xiàn)優(yōu)于另一種構(gòu)象。

　　linker肽的長度和序列在確定scFv抗體的結(jié)合特性、特異性、折疊和溶解度方面起著重要作用。linker大多在15-20個(gè)氨基酸序列內(nèi)，富含甘氨酸和絲氨酸殘基，也可以優(yōu)化到多達(dá)35個(gè)氨基酸。linker在兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的羧基和氨基末端之間的距離為3.5nm(35 Å)。富含甘氨酸-絲氨酸的linker序列因其柔韌性而最常用。不過體外研究表明，linker中的重復(fù)序列在基于PCR的實(shí)驗(yàn)中存在問題，似乎具有免疫原性，并且與非重復(fù)linker相比，穩(wěn)定性較差。此外，絲氨酸，特別是和其他帶電殘基，如谷氨酸和賴氨酸，如果包含在linker序列中可以提高scFv的剛性和溶解度。

　　通過設(shè)計(jì)不同的linker，可產(chǎn)生各種形式的多聚體，如二聚體、三聚體和雙特異性抗體。關(guān)于linker序列設(shè)計(jì)，最初由Huston等設(shè)計(jì)使用的15-聚體(G4S)3，是五肽GGGGS的多聚體。此后，(G4S)n接頭氨基酸序列基序用作基本支架，其中18-聚體GGSSRSSSGGGGSGGGGG和20-聚體(G4S)4是一些常用的多聚體。

　　根據(jù)所采用的 scFv 抗體和linker肽的數(shù)量，生成了基于 scFv 的不同形式的抗體結(jié)構(gòu)。例如，串聯(lián) scFv 通過 NH2-VL1-VH1-(linker-VL2-VH2)n-COOH 構(gòu)型中的螺旋肽linker在單個(gè)轉(zhuǎn)錄本中連接兩個(gè)或多個(gè) scFv。這些結(jié)構(gòu)生成具有雙價(jià)和/或雙特異性結(jié)合位點(diǎn)的生物制劑，可以以更大的親和力靶向特定抗原，或同時(shí)靶向兩個(gè)不同的抗原(圖1b和1c)。

　　scFv抗體可以通過多聚化技術(shù)進(jìn)一步修飾，增加其分子量、親和力和靈敏度。也可以通過來自兩種不同抗體分子的兩條不同鏈的相互作用來修飾，稱為二價(jià)二聚體(diabody，圖1d)。其中一種形式稱為雙親和重靶向蛋白(DART)，使用兩條不同的鏈生成雙特異性二價(jià)二聚體，其中第一條鏈包含來自抗體 1 的 VH 和來自抗體 2 的 VL，第二條鏈包含來自抗體 2 的 VH 和來自抗體 1 的 VL(圖 1e)。然后在兩種多肽之間添加鏈間二硫鍵，提高分子的穩(wěn)定性，降低同型二聚體的聚集程度。此外，通過在一條鏈中連接三個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，可以以類似于二元體的方式產(chǎn)生三價(jià)、四價(jià)(圖1f)或五價(jià)結(jié)構(gòu)。

　　圖1 scFv抗體及其他scFv形式的示意圖。

　　(a) scFv抗體：VH的C末端通過一個(gè)富含甘氨酸和絲氨酸殘基的靈活肽鏈連接到VL的N末端。

　　(b) 由兩個(gè)相同的scFv構(gòu)成的二價(jià)單特異性串聯(lián)scFv，通過螺旋鏈連接。

　　(c) 由兩個(gè)不同的scFv構(gòu)成的二價(jià)雙特異性scFv，通過螺旋鏈連接。

　　(d) 雙特異性scFv形式由兩個(gè)分開的鏈組成，每個(gè)鏈包含來自不同抗體的VL和VH，以頭尾排列。

　　(e) 雙特異性雙DART®形式scFv由兩個(gè)不同的多肽鏈組成，通過非共價(jià)鍵和二硫鍵的相互作用連接在一起。

　　(f) 四價(jià)雙特異性分子(TandAb)由兩個(gè)diabody以線性排列連接構(gòu)成。

　　2.2. scFv抗體的優(yōu)點(diǎn)

　　與全長單克隆抗體相比，scFv 抗體具有多項(xiàng)優(yōu)勢，包括其固有特性，如大小、免疫原性效應(yīng)、表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)。

　　(1)scFv 抗體的尺寸較小(Mwt為27 kDa)，即比完全抗體(150 kDa)小五分之一，因此易于穿透腫瘤組織并到達(dá)隱秘表位。

　　(2)由于其體積小，其從血液和非靶組織中的快速清除能力得到了增強(qiáng)。

　　(3)scFv抗體分子可以在微生物表達(dá)系統(tǒng)中輕松生產(chǎn)和操作，該系統(tǒng)可以在短時(shí)間內(nèi)以較低的成本產(chǎn)生更高的劑量。

　　(4)scFv 的免疫原性較弱，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈せ羁贵w效應(yīng)器功能的 Fc 結(jié)構(gòu)域。

　　(5)scFv具有與親本抗體相同的抗原結(jié)合能力，甚至可以與其他潛在分子偶聯(lián)，以提高其活性、穩(wěn)定性和親和力，從而更傾向于結(jié)合靶分子。

　　2.3. scFv抗體的產(chǎn)生

　　產(chǎn)生scFv抗體的基本方案如下所示(圖2)。

　　圖2 制備scFv抗體的基本程序。從重排的可變基因片段中獲得的抗體庫可以來源于原始B細(xì)胞、激活的B細(xì)胞和通過計(jì)算機(jī)模擬獲得的合成庫。經(jīng)過mRNA富集后，使用PCR組裝scFv庫，并將其克隆入噬菌體載體中，從而在噬菌體表面表達(dá)scFv庫。將噬菌體庫與目標(biāo)配體孵育后，進(jìn)行洗滌步驟以去除所有未結(jié)合的噬菌體。所有結(jié)合的噬菌體被洗脫并在大腸桿菌中擴(kuò)增，這些噬菌體可用于進(jìn)一步的篩選，以獲取特異性結(jié)合子。

　　2.3.1. mRNA的分離和VH和VL基因的PCR擴(kuò)增

　　目前，由免疫文庫和通用文庫組成的幾種細(xì)胞和合成抗體文庫已被用作生成多種抗體形式的來源(圖2)。免疫文庫是從免疫動(dòng)物或人類組織或血液(如骨髓、外周血單核細(xì)胞(PBMC)、脾臟、雜交瘤細(xì)胞系和任何細(xì)胞成分的樣本中產(chǎn)生的。通用庫分為天然庫、合成庫和半合成庫。天然文庫來源于未免疫供體的重組Ig V基因，具有組合性質(zhì)，在文庫構(gòu)建過程中，重鏈和輕鏈隨機(jī)組合。合成文庫是利用分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)的，目的是增強(qiáng)重組抗體。半合成文庫通常來源于天然抗體和合成抗體序列的組合。

　　對于免疫和非免疫供體，通過分離總 RNA產(chǎn)生編碼 VH 和 VL 抗體結(jié)構(gòu)域的基因片段。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA，cDNA被用作相關(guān)基因PCR擴(kuò)增的模板(圖2)。使用正向和反向引物，擴(kuò)增 cDNA 片段可創(chuàng)建一個(gè)包含各種 VH 和 VL 抗體基因的龐大文庫。

　　2.3.2. 接頭肽的引入和全長scFv結(jié)構(gòu)域的克隆

　　linker編碼一個(gè)15肽(Gly4Ser)3，該肽位于VH和VL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間。首先，linker分別添加在每個(gè)可變區(qū)的前后，然后使用重疊延伸PCR(SOE-PCR)的兩步法進(jìn)行組裝。在組裝PCR中，VH和VL區(qū)域應(yīng)以等量存在，但可以降低linker引物的濃度，以防止某一域的優(yōu)先擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，隨后將適當(dāng)?shù)钠嗡腿y序平臺進(jìn)行測序。生成完整的scFv，其方向可能為VH-(Gly4Ser)3-VL或VL-(Gly4Ser)3-VH，并通過設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行克隆。

　　2.3.3.載體克隆、噬菌體展示和轉(zhuǎn)化

　　編碼scFv抗體的基因插入到噬菌體內(nèi)，并連接到DNA的C末端區(qū)域，而展示的肽則附著在基因的外部N末端。用于噬菌體展示的噬菌體有幾種，但最常用的是絲狀噬菌體M13，還有其他噬菌體，如Lambda、T4和T7也被使用。M13對宿主細(xì)菌無裂解作用，并通過細(xì)菌細(xì)胞膜分泌產(chǎn)生噬菌體顆粒。M13擁有兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白用于抗體片段的表達(dá)：基因III和VIII。由于表面展示的肽拷貝數(shù)較少，基因III蛋白被廣泛使用。

　　按照相關(guān)PCR的標(biāo)準(zhǔn)方案，將scFv抗體編碼片段與噬菌體外殼蛋白基因融合。然后，將線性PCR產(chǎn)物擴(kuò)增并環(huán)化，再通過電穿孔或化學(xué)誘導(dǎo)的感受態(tài)轉(zhuǎn)化到E. coli細(xì)胞(如XL1-Blue、TG1和ER2537)中(圖2)。為了釋放包含所需片段的克隆載體，感受態(tài)細(xì)菌會感染輔助噬菌體，如VCSM13、M13KO7等。E. coli隨后會生產(chǎn)大量展示各種肽序列的噬菌體，通常大小為10^6到10^11，具體取決于所研究的文庫類型。從中構(gòu)建并篩選抗體可變區(qū)文庫，以尋找對特定分子(如酶、抗體和目標(biāo)細(xì)胞的表面受體)具有高親和力的肽。這些體外篩選過程稱為生物淘選(biopanning)。通過這個(gè)過程，可以確定小片段抗體對目標(biāo)抗原的結(jié)合力、親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。

　　淘選步驟包括：將展示文庫與固定在固體支持物(如珠子、膜等)上的配體進(jìn)行孵育;通過洗滌緩沖液去除未結(jié)合的噬菌體;洗脫結(jié)合的噬菌體;并將其重新感染E. coli細(xì)胞(圖3)。最終，會生成一個(gè)每個(gè)噬菌體表面上都表現(xiàn)出單一抗體片段的噬菌體文庫。通常會使用多輪結(jié)合(大多數(shù)情況下四到六輪)和擴(kuò)增來選擇展示抗體片段并緊密結(jié)合目標(biāo)分子的抗原特異性噬菌體克隆。最后，通過DNA測序?qū)γ總€(gè)克隆進(jìn)行標(biāo)記，以揭示它們不同的CDR(互補(bǔ)決定區(qū))。

　　圖3 噬菌體展示篩選示意圖。將編碼目標(biāo)scFv的基因片段與噬菌體外殼蛋白編碼基因融合。展示scFv抗體的噬菌體文庫通過與抗原(以其天然形式存在)孵育進(jìn)行親和力選擇，抗原可以固定在磁珠或固體表面上。所有未結(jié)合的噬菌體(或弱結(jié)合)通過洗滌去除，而牢固結(jié)合的噬菌體則通過改變pH條件回收。E. coli細(xì)胞與輔助噬菌體共同感染釋放新噬菌體顆粒，用于隨后的篩選周期，這些周期通常包括3到4輪。最后，通過噬菌體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(phage ELISA)對結(jié)合物進(jìn)行富集，并隨后回收所需的scFv抗體。

　　2.3.4. scFv抗體的表達(dá)

　　展示技術(shù)有助于在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中快速篩選多個(gè)抗體片段，并產(chǎn)生具有高特異性的純抗體分子。小片段分子已使用多種表達(dá)系統(tǒng)成功展示，包括真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(基于酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)、原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(基于細(xì)菌細(xì)胞)和無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(核糖體展示)。

　　(1)原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。因?yàn)樵思?xì)胞表達(dá)系統(tǒng)價(jià)格低廉，并且可以在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中快速生長。因此，可以在生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)過程中產(chǎn)生高生物質(zhì)和蛋白質(zhì)產(chǎn)品。使用最廣泛的可能是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其基因組簡單且易于分析，表達(dá)產(chǎn)量較高。但表達(dá)的蛋白產(chǎn)物缺乏翻譯后修飾和正確的折疊，因此，需要通過各種變性劑進(jìn)行額外的增溶，并在純化后進(jìn)行進(jìn)一步的體外復(fù)性步驟。

　　(2)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。對于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，最常用的菌株是來自真菌界的單細(xì)胞酵母，包括畢赤酵母(Pichia pastoris)和啤酒酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。它們在培養(yǎng)中生長得速度快，并且能提供比任何其他表達(dá)平臺(如桿狀病毒和哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng))更高的表達(dá)水平。它們還具有真核細(xì)胞的許多優(yōu)點(diǎn)，包括蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾。

　　(3)無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：核糖體展示技術(shù)。

　　基于表型與基因型固有關(guān)聯(lián)性，針對目標(biāo)配體篩選有效抗體的體外選擇方案。其主要目的是解決細(xì)胞和噬菌體展示方法的缺陷，通過體外生成三元蛋白-核糖體-mRNA復(fù)合物。在選擇過程中，mRNA-蛋白復(fù)合物會結(jié)合到固定的配體上，從而暴露復(fù)合物中的mRNA，進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA序列，最終通過PCR擴(kuò)增。隨后，通過3-5輪篩選獲得特定的抗體片段(圖4)。特定產(chǎn)物的DNA編碼文庫被連接到一個(gè)由終止密碼子阻斷的間隔序列上。在體外翻譯過程中，間隔序列與肽基tRNA連接，占據(jù)核糖體的軸。這樣，正確折疊的目標(biāo)蛋白會從核糖體復(fù)合物中突出，結(jié)合到固體表面上的固定配體上。常用的表面材料包括硝酸纖維素、柱狀基質(zhì)、磁珠、聚苯乙烯管和96孔微量滴定板。在洗滌步驟中，所有未結(jié)合的復(fù)合物會被清除。而結(jié)合的復(fù)合物中的mRNA通過原位RT-PCR被回收。最終，通過ELISA確認(rèn)所有識別的抗體克隆，并在必要時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行體外親和力成熟步驟，以提高小片段分子的穩(wěn)定性和/或親和力。然后，對個(gè)體結(jié)合劑進(jìn)行測序和進(jìn)一步的生化特征分析。這些方法有效地篩選出大量編碼DNA文庫，選擇高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)闆]有細(xì)胞培養(yǎng)的參與，與其他受轉(zhuǎn)化效率和翻譯后修飾限制的展示技術(shù)相比更加高效。

　　圖4 體外核糖體展示示意圖。首先，免疫供體生成感興趣的scFv抗體的DNA文庫。經(jīng)過mRNA富集處理以獲得VH和VL片段的文庫后，通過體外翻譯生成含有目標(biāo)生物體的三元蛋白–核糖體–mRNA復(fù)合物。該復(fù)合物通過結(jié)合目標(biāo)配體進(jìn)行選擇。接下來，回收scFv的DNA文庫，并對其進(jìn)行擴(kuò)增，以便進(jìn)行進(jìn)一步的選擇循環(huán)或后續(xù)分析。因此，DNA文庫可以通過體外轉(zhuǎn)錄與翻譯耦合的方法一次或多次擴(kuò)增，形成mRNA、相關(guān)的生物體以及核糖體復(fù)合物(PRM復(fù)合物)，該復(fù)合物通過與固相上的抗原結(jié)合進(jìn)行選擇。

　　2.3.5. scFv抗體的純化

　　在其生產(chǎn)周期和表達(dá)系統(tǒng)中，抗體片段可能會被雜質(zhì)污染，包括內(nèi)毒素、內(nèi)源性病毒、宿主細(xì)胞蛋白、DNA 和其他聚集體，這些物質(zhì)應(yīng)通過有效的純化方法去除。用硫酸銨、聚乙二醇、依沙吖啶和辛酸處理的初步步驟可用于增加抗體片段的濃度。然而，沉淀的純度、選擇性、重現(xiàn)性和產(chǎn)量會受到多種因素的影響，如溫度、時(shí)間、pH 值和鹽化速率。用于表達(dá)的細(xì)菌菌株也會影響細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵的形成。

　　表達(dá)系統(tǒng)的差異也使片段分子需要經(jīng)過不同的純化步驟。因此，在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的抗體片段首先通過裂解細(xì)胞而釋放，用不同的去污劑溶解，然后重新折疊至其適當(dāng)?shù)臉?gòu)象，這與通過細(xì)菌包膜從周質(zhì)空間分泌的抗體片段不同。此外，抗體可以根據(jù)其一般的、可預(yù)測的結(jié)構(gòu)、大小和化學(xué)性質(zhì)，以及對特定類別抗體(如 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE)具有更強(qiáng)親和力的蛋白質(zhì)的相互作用以及由它們衍生的片段結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離。建議采用多模式純化方法，通過各種層析平臺相互結(jié)合、與親和標(biāo)簽偶聯(lián)以及非層析方法，以獲得所需應(yīng)用的高純度抗體片段。

　　3. scFv抗體的應(yīng)用

　　目前，基于scfv抗體的免疫療法和診斷在腫瘤學(xué)、自身免疫性疾病、神經(jīng)病變、慢性炎癥性疾病和各種傳染病中受到高度重視。scfv也可用于食品危害因子檢測，例如抗生素、毒素、過敏原、非法添加劑、殺蟲劑和化學(xué)品等。

　　3.1. 治療

　　目前有近 1,200 種治療性抗體處于臨床試驗(yàn)階段。其中約175例正在接受監(jiān)管審查，約140例正在接受關(guān)鍵的2期、2/3期或3期臨床試驗(yàn)(稱為“late-stage”)的評估。此外，預(yù)計(jì)將有700多個(gè)mAb用于臨床前和臨床開發(fā)。根據(jù)美國食品和藥物管理局(US FDA)的數(shù)據(jù)，這些mAb中有106種被批準(zhǔn)用于癌癥治療。由于缺乏 FcR，傳統(tǒng)mAb募集 T 細(xì)胞的能力有限。因此，大多數(shù)基于 scFv 的形式被設(shè)計(jì)為多特異性，以實(shí)現(xiàn)將 T 細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (CD3+) 與特定腫瘤抗原家族相連的潛力。所有雙特異性形式都具有高于單價(jià)片段的親和力和特異性。由于其尺寸微小，scFv抗體主要與其他分子偶聯(lián)，以產(chǎn)生具有高親和力和特異性的蛋白質(zhì)，用于靶向治療和揭示幾種疾病病理，如癌癥、自身免疫綜合征、神經(jīng)退行性疾病等。

　　3.2分子生物成像

　　基于scFv的分子生物成像可以改善現(xiàn)代治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的診斷和治療應(yīng)用。在大多數(shù)情況下，傳統(tǒng)的成像方法不是靶向的，在檢測疾病階段時(shí)靈敏度較低，可能會誤導(dǎo)醫(yī)生的決策。但基于 scFv 抗體的成像是針對確定的抗原的，因此可以快速診斷病理狀態(tài)，并且由于它們從血液中快速清除，可以被用作成像探針。如果scfv被設(shè)計(jì)為通過與熒光蛋白或酶融合來產(chǎn)生靈敏的檢測探針，它們將成為診斷耐藥病原體和相關(guān)生物膜的良好替代品。

　　3.3食品中危害因子的檢測

　　免疫分析是現(xiàn)場快速篩查的常用方法。在免疫傳感分析中，特異性抗體被用作傳感器材料表面的生物識別元件，以便能夠檢測這些危害因子。當(dāng)前已有研究應(yīng)用scfv開發(fā)快速免疫分析方法，例如scFv 與 IC-ELISA 的結(jié)合是可靠的方法之一，可以輕松檢測抗菌劑。例如，通過噬菌體展示和定向進(jìn)化成功構(gòu)建了針對環(huán)丙沙星的scFv(CIP)。同樣，針對抗生素諾氟沙星的scFv和針對氨芐青霉素的scFv作為堿性磷酸酶融合蛋白有效地從雜交瘤細(xì)胞中構(gòu)建出來。此外，基于 scFv 的雜交基因，可以同時(shí)檢測三種抗生素，包括氯霉素 (CAP)、環(huán)丙沙星 (CPFX) 和磺胺嘧啶 (SM2)。另一種設(shè)計(jì)的scFv抗體也固定在羧酸磁珠表面，以高靈敏度和特異性有效捕獲雞肌肉中的馬杜拉霉素抗生素殘留。

　　4. scFv抗體的挑戰(zhàn)和局限性

　　4.1 scfv抗體自身的局限性

　　(1)scFv 抗體中缺少 Fc 結(jié)構(gòu)域使得該分子的熱穩(wěn)定性不如親本 mAb，而缺乏 Fcrn 介導(dǎo)的再循環(huán)使分子容易出現(xiàn)較短的循環(huán)半衰期。

　　(2)同樣，生物制劑的微小尺寸促進(jìn)了聚集趨勢，從而產(chǎn)生具有增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的分子。從循環(huán)中被快速清除導(dǎo)致需要更高和重復(fù)的劑量。將 scFv 與牛血清白蛋白 (BSA) 或聚乙二醇 (PEG) 融合的方法可能提高其半衰期保留率，但由于分子大小的增加和實(shí)驗(yàn)成本的增加，它們的劣勢也可能蓋過scFv相較于mAb的優(yōu)點(diǎn)。

　　(3)linker肽的組成可以影響目標(biāo)生物制劑的理化性質(zhì)及其體內(nèi)活性。重復(fù)linker被認(rèn)為會導(dǎo)致與基于PCR的方法和免疫原性相關(guān)的問題。替代的非重復(fù)linker已被用于改善其體內(nèi)活性，但與重復(fù)linker相比它們的靈活性較差。

　　4.2 scfv抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)存在的挑戰(zhàn)

　　與生成重組全長抗體相關(guān)的挑戰(zhàn)同樣適用于小片段抗體分子，包括但不限于使用生物工程重組抗體、表達(dá)、純化、安全性和穩(wěn)定性控制平臺的技術(shù)。

　　(1)噬菌體展示技術(shù)用于產(chǎn)生全人源或人源化的scFv抗體分子，存在實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性、時(shí)間長、生產(chǎn)成本高等問題。

　　(2)使用整合了人類免疫球蛋白位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，需要將重組基因整合到新產(chǎn)生的宿主動(dòng)物中，程序繁瑣。

　　(3)為產(chǎn)生具有VL和VH結(jié)構(gòu)域自然組合的天然人類抗體而開發(fā)的單B細(xì)胞技術(shù)涉及諸如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)和微孔板等篩選技術(shù)，以找出表達(dá)目標(biāo)抗體的單細(xì)胞，仍然是非常昂貴的過程。

　　4.3 scfv表達(dá)系統(tǒng)的局限性

　　(1)使用的表達(dá)系統(tǒng)限制了scFv 抗體的構(gòu)象折疊和產(chǎn)量。原核系統(tǒng)在表達(dá)過程中缺乏蛋白質(zhì)糖基化，還會形成內(nèi)毒素，難以從培養(yǎng)基中去除。

　　(2)真核生物單細(xì)胞表達(dá)則存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER 內(nèi)分子錯(cuò)誤折疊的問題。盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可用于減輕蛋白質(zhì)折疊和糖基化模式的限制，但這些細(xì)胞系之間的遺傳變異性可能會將不同的末端聚糖表位添加到與人類自然構(gòu)象不同的重組蛋白中，因此可能不是生產(chǎn)抗體片段的良好平臺。

　　(3)最近開發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)也受到提取、純化程序和微生物表達(dá)系統(tǒng)等有限糖基化模式的影響。

　　(4)使用昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)也受到N-連接糖基化的翻譯后修飾的限制，以及由于病毒以裂解方式感染昆蟲細(xì)胞而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)染困難，妨礙了重組蛋白在批量培養(yǎng)中的持續(xù)生產(chǎn)。

　　(5)另一方面，scFv 抗體蛋白的純化更為復(fù)雜，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中沒有 Fc 結(jié)構(gòu)域。因此，無法通過蛋白A或蛋白G親和層析進(jìn)行純化，需要多模式操作，包括不同的色譜和非色譜相互作用。為了選擇性捕獲和高效純化，scFv抗體通常會融合親和標(biāo)簽，但在末端的蛋白酶切割可能無法完全去除標(biāo)簽，并留下部分殘余氨基酸，這可能導(dǎo)致scFv抗體的聚集和/或錯(cuò)誤折疊，甚至增加其免疫原性。

　　5. 未來展望

　　(1)將scFv抗體與其他免疫分子如細(xì)胞因子或趨化因子進(jìn)行基因融合，可以有效地將抗體分子定向到疾病區(qū)域或在病理?xiàng)l件下表達(dá)的特定分子上。減少了抗體片段對健康細(xì)胞的不利影響，從而通過靶向其生物活性來提高其治療指數(shù)。此外，scFv抗體具有更強(qiáng)的靈活性，由于其片段小，可以被修飾以解決全長mAbs在實(shí)體瘤治療和診斷中相關(guān)的療效問題。

　　(2)抗體分子通常局限于細(xì)胞外環(huán)境，因?yàn)樗鼈儫o法穿越脂質(zhì)雙層。但scFv抗體可以通過與納米載體、細(xì)胞穿透肽結(jié)合，或構(gòu)建具有識別細(xì)胞表面受體的序列結(jié)構(gòu)，從而通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞。因此，它將僅識別癌細(xì)胞的目標(biāo)分子，減輕化療和放療帶來的副作用。

　　(3)由于重組抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，scFv抗體的分子量、結(jié)合親和力、化合價(jià)等特性可以根據(jù)應(yīng)用目的進(jìn)行大幅度的修改和優(yōu)化。生產(chǎn)成本、與治療費(fèi)用相關(guān)的上市后問題以及藥代動(dòng)力學(xué)特性都有望得到大幅改善，有望解決制藥公司和患者的巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

　　(4)除了用于親和力選擇的展示技術(shù)外，利用生物信息學(xué)能夠更容易地分析所研究的scFv抗體結(jié)構(gòu)中的誘導(dǎo)突變，特別是針對CDR，通過隨機(jī)或熱點(diǎn)誘變來預(yù)測其對天然抗體的高親和力特性。