吡蟲啉和甲基對(duì)硫磷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用的殺蟲劑,吡蟲啉屬于新型煙堿類殺蟲劑,主要用于防治水稻、玉米等作物上的刺吸式口器害蟲,而甲基對(duì)硫磷屬于有機(jī)磷酸酯類殺蟲劑,用于防治蘋果、棉花等作物上的害蟲。這兩種農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不當(dāng)使用已經(jīng)嚴(yán)重危害到環(huán)境質(zhì)量和人類健康,因此,建立一個(gè)針對(duì)這兩種農(nóng)藥的快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏的殘留分析方法已勢(shì)在必行。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)因其比傳統(tǒng)的儀器分析方法具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、適宜現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣品篩選等優(yōu)點(diǎn),在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。 本文先利用雜交瘤制備技術(shù)成功獲得了抗吡蟲啉單克隆抗體,在此基礎(chǔ)上,利用雜交-雜交瘤制備技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞二次融合,獲得了抗體吡蟲啉-甲基對(duì)硫磷雙特異性單克隆抗體,并分別建立起了基于兩種抗體的ELISA檢測(cè)體系。具體如下： 本研究首先以吡蟲啉為研究對(duì)象,采用分子模擬技術(shù)分析了吡蟲啉及其類似農(nóng)藥的電荷分布,選擇1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亞胺(H1)作為免疫半抗原,1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亞胺(H2)作為包被半抗原,利用NHS酯法將H1和H2分別與牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)合成免疫原與包被原。免疫BALB/c小鼠后,采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)共獲得2株穩(wěn)定分泌抗吡蟲啉單克隆抗體的細(xì)胞株2F11/A9和2G6/G12,其分泌的抗體類型分別為IgG3和IgG1,與吡蟲啉形成的抗原-抗體復(fù)合物的電離常數(shù)分別為1.1×10-10mol/L和3.4x 10-9mol/L。隨后,選擇2F1 1/A9分泌的抗體進(jìn)行了ELISA分析方法的建立,通過(guò)研究有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度、pH值對(duì)抗原抗體反應(yīng)靈敏度的影響,優(yōu)化了吡蟲啉間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(IC-ELISA)的分析條件,確定了含5%丙酮的PBST、0.2 M的離子強(qiáng)度、8.0的pH值作為吡蟲啉IC-ELISA的最佳工作條件。利用優(yōu)化后的分析條件,用IC-ELISA法進(jìn)行了方法靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度的分析,結(jié)果表明,檢測(cè)體系的IC50為5.3 ng/mL,檢測(cè)限為1.1 ng/mL,與6種吡蟲啉的結(jié)構(gòu)類似物均無(wú)明顯的交叉反應(yīng)。添加回收試驗(yàn)表明該方法可以用于自來(lái)水、土壤和包菜樣品中吡蟲啉農(nóng)藥殘留的檢測(cè),添加回收率為85.5%-118.0%,變異系數(shù)為1.0%-4.7%。 在此基礎(chǔ)上,本研究對(duì)分泌抗吡蟲啉抗體的雜交瘤細(xì)胞株2F11/A9在5-溴-2-脫氧尿苷(5-BrdU)培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞胸苷激酶(TK)缺失；對(duì)分泌抗甲基對(duì)硫磷的雜交瘤細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)室先前制備保存)在8-雜氮鳥嘌呤(8-AG)培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺失。然后采用三體雜交瘤和四體雜交瘤制備技術(shù)分別獲得了一株能分泌抗吡蟲啉-甲基對(duì)硫磷的雙特異性單克隆抗體的三體雜交瘤細(xì)胞(LG-D6)和四體雜交瘤細(xì)胞(LG-A2)。將LG-D6制備腹水,通過(guò)一系列的反應(yīng)緩沖體系的篩選和優(yōu)化,建立了相應(yīng)ELISA方法。從靈敏度結(jié)果可知,雙特異性單克隆抗體對(duì)吡蟲啉和甲基對(duì)硫磷的檢測(cè)靈敏度分別為69.8 ng/mL和1.9ng/mL。交叉反應(yīng)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的雙特異性單克隆抗體除與氯噻啉、對(duì)硫磷、殺螟硫磷有交叉反應(yīng)之外,與其余的結(jié)構(gòu)類似物均無(wú)明顯交叉反應(yīng)。對(duì)水質(zhì)樣品中的吡蟲啉和甲基對(duì)硫磷進(jìn)行添加回收率試驗(yàn),添加回收率均在87.4%-104.0%之間,表明所建立的免疫分析方法準(zhǔn)確可靠。 通過(guò)以上試驗(yàn)研究,本文建立起了吡蟲啉殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法并初步提出了較為系統(tǒng)的基于雜交-雜交瘤技術(shù)的雙特異性單克隆抗體制備技術(shù)體系、建立了相應(yīng)的ELISA分析方法,為相關(guān)免疫檢測(cè)產(chǎn)品的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
