以下主要介紹如何根據(jù)需求選擇合適的抗體、抗體處理及儲存、抗體驗(yàn)證及疑難解答等方面。

　　您將學(xué)到如何正確儲存及處理您的抗體。大多數(shù)保存得當(dāng)?shù)目贵w，其活性保持時間可長達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年。

　　請記住，務(wù)必參考制造商提供的數(shù)據(jù)表，以獲取具體儲存建議！

1 新抗體的處理

　　收到新抗體后，請采取以下措施：

離心

　　重中之重：收到抗體后，對裝有抗體的小瓶進(jìn)行離心。運(yùn)輸過程中，瓶內(nèi)液體發(fā)生晃動，因此會有液體滯留在蓋子上。將小瓶放在離心機(jī)上快速離心(10,000 xg，20 秒)，可以確保珍貴的抗體回落到小瓶底部，以確保抗體全部可用。

分裝

　　使用時，您不會希望反復(fù)從冰箱中取出再放回整個小瓶，因此，不妨按 10 µL 一份分裝抗體。這樣，您可以隨時按需取用抗體。分裝量越少，濃度就越容易受到蒸發(fā)以及儲存瓶表面吸附的影響，因此分裝量不應(yīng)少于 10 µL。

　　為防止微生物污染，在抗體溶液中應(yīng)加入疊氮化鈉，其終濃度為 0.02%(質(zhì)量百分比)。需要指出的是，如果用抗體對活細(xì)胞進(jìn)行染色或處理，或者用抗體進(jìn)行 in vivo 研究， 請勿使用 疊氮化鈉。這種抗菌劑對大部分生物體都有毒害作用，因?yàn)樗鼤钄嗉?xì)胞色素電子傳遞系統(tǒng)。

儲存

　　關(guān)于儲存，請記住，反復(fù)凍融可使抗體變性，使其形成聚合物，從而降低抗體的結(jié)合能力。因此，請確保分裝后的抗體只凍融一次，如有剩余，可在 4°C 下保存。您應(yīng)該將抗體儲存在 -20°C，因?yàn)?-80°C 下儲存抗體并無明顯優(yōu)勢。大多數(shù)情況下，收到抗體后可在 4°C 下儲存一周至兩周。

　　避免使用無霜冰箱：雖然您的實(shí)驗(yàn)室不太可能會反復(fù)凍融，但還是要提醒您應(yīng)避免反復(fù)凍融。同理，抗體應(yīng)該放置于冰箱中溫度變化最小的部位，如應(yīng)放置于冰箱格里，而不應(yīng)放置于冰箱門上。

2 偶聯(lián)抗體的儲存

　　平常多留意偶聯(lián)抗體，因?yàn)樗鼈儽任磁悸?lián)抗體更復(fù)雜。以下是關(guān)于正確儲存和處理偶聯(lián)抗體的幾點(diǎn)建議。

　　*凍溶酶聯(lián)抗體不僅會降低酶的活性，還會影響抗體結(jié)合能力。除非抗體內(nèi)含冷凍保護(hù)劑并且其長期儲存在 -20°C 下的穩(wěn)定性已經(jīng)通過驗(yàn)證，否則切勿凍存酶聯(lián)抗體，應(yīng)將其保存在 4°C 下。

小結(jié)

　　• 新抗體以 10,000 xg 離心 20 秒，使液體回流至瓶底

　　• 抗體可短期儲存在 4°C 下(1 - 2 周)

　　• 分裝，每份 ≥ 10 µL

　　• 分裝抗體僅可凍融一次

　　• 僅在需要時加入疊氮化鈉，勿對 HRP 偶聯(lián)抗體使用疊氮化鈉

　　• -20°C 下長期儲存抗體，除非制造商數(shù)據(jù)表另有要求

　　• 務(wù)必參考制造商提供的數(shù)據(jù)表，以獲取具體儲存建議

　　• 請勿使用無霜冰箱

　　• 抗體可以儲存在 -80°C，但沒有必要，除非供應(yīng)商明確建議如此

去除疊氮化鈉的實(shí)驗(yàn)方案

　　將疊氮化鈉從抗體溶液中去除的具體步驟

　　疊氮化鈉是一種用于抑制污染物(如細(xì)菌或真菌)生長的防腐劑。然而，它在抗體溶液中的存在會影響細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗體的使用，因?yàn)樗屑?xì)胞毒性。它還會干擾抗體和偶聯(lián)物的偶聯(lián)，以及抑制辣根過氧化物酶的活性。

　　許多抗體產(chǎn)品含有疊氮化鈉，這個信息是在各個抗體的數(shù)據(jù)表上都會列出。如果該抗體是用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或需要偶聯(lián)，建議從抗體溶液中去除疊氮化鈉。

下面的幾個步驟可以用來除去疊氮化鈉。

透析

　　一個透析裝置可以用來將0.1毫升到70毫升的樣品中的疊氮化鈉去除。這是一種半透膜，可以選擇較寬范圍的不同大小尺寸和孔徑大小。使用一個孔徑大小可以截留10-30kDa大小以上物質(zhì)的膜將允許疊氮化物通過膜，但在溶液中將保留抗體和其他蛋白。

IgG的分子量為150 kDa（IgM為600 kDa）。疊氮化鈉的分子量是65 Da。

所需材料

　　·可以容納樣本體積的合適直徑和長度的透析膜/管(10-30 kDa分子量被截留)

　　·透析緩沖液，如PBS,TBS or HEPES (pH 范圍6–8)

　　·大燒杯

　　·4°C工作的磁力攪拌機(jī)

　　·攪拌子

步驟

1.按照制造商的建議，組裝透析裝置。用透析緩沖液預(yù)先潤洗透析裝置1-2分鐘的時間來使膜潤濕。

2.將抗體溶液轉(zhuǎn)移至透析裝置。

3.將透析裝置放入一個裝有至少1 L緩沖液的合適大小的燒杯中，并將燒杯放在一個磁攪拌器上來讓抗體被透析出來，在4°C的情況下至少透析1 h。

4.更換緩沖液然后再透析至少一小時，重復(fù)更換緩沖液至期望的次數(shù)為止。確保緩沖液至少更換了3遍。

如果可能的話，所有的材料都應(yīng)該消毒，并相應(yīng)的準(zhǔn)備操作保持無菌。由于抗體不再受防腐劑的保護(hù)，因而推薦將抗體保持在低溫條件

脫鹽

　　該步驟適用于體積較小的1-3毫升，脫鹽柱有尺寸排阻性，由具有一定孔隙大小的小顆粒組成。

　　尺寸排阻是一種根據(jù)分子量來分離溶液中分子的方法。不同分子量的粒子將以不同速率通過尺寸排阻基質(zhì)洗脫下來。例如，大分子不能進(jìn)入基質(zhì)的孔隙，因此首先被洗脫下來，而較小的分子則會滲入珠子而最后才被洗脫下來。

　　Sephadex G25色譜柱系統(tǒng)或等效的裝置能有效地從抗體樣品中去除疊氮化鈉。預(yù)包裝的Sephadex離心柱是現(xiàn)成的，可用于此過程。

所需材料

　　·Sephadex G25 離心柱

　　·平衡緩沖液

　　·離心機(jī)

步驟

1.如果使用商業(yè)化的純化柱，使用時請參考制造商的說明書

2.去除離心柱上的蓋子，然后1000g離心2分鐘以除去存儲液。

3.把柱子放在收集管里。

4.按制造商的建議用平衡緩沖液填滿柱子，然后1000g離心2分鐘。

5.重復(fù)3次，然后丟棄穿透液。

6.將1-3ml抗體樣品緩慢地加入到填充層的中央，并1000g離心2分鐘。

7.收集并回收在收集管中的洗脫液(抗體)。