【摘要】
在快速診斷技術(shù)中，側(cè)流免疫層析法（LFA）因其便攜性、操作簡便和快速出結(jié)果的特點而備受關(guān)注。但是，LFA的主要缺點是有限的敏感性和選擇性。為了解決這些問題，研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種創(chuàng)新策略，如樣本富集、分析條件優(yōu)化和信號放大。但是抗體定向問題卻常常被忽略，而不適宜的定向可能會顯著降低檢測性能。
本文首先探討了傳統(tǒng)方法，比如細(xì)微的物理性調(diào)整和非特異性化學(xué)鍵的形成，然后重點討論了抗體定向固定在探針表面上，旨在通過利用蛋白質(zhì)間的親和力或互補的氨基酸序列從根本上提升檢測的靈敏度和選擇性。本文總結(jié)了抗體定向?qū)FA分析性能在靈敏度、特異性、檢測速度、可靠性、成本效益和穩(wěn)定性方面的影響。此外，文章還介紹了對檢測膜材料的最新改進(jìn)，并探討了LFA目前的局限性和未來的發(fā)展?jié)摿Α?/span>
LFA 具有多功能性，可在各種環(huán)境中應(yīng)用，包括實驗室、醫(yī)療中心和日常生活。COVID-19大流行期間，臨床資源分配不均和醫(yī)務(wù)人員短缺加劇了混亂，導(dǎo)致疫區(qū)擴(kuò)大和死亡率上升。這凸顯了對快速、中等準(zhǔn)確度的市售診斷工具的需求。LFA提供了一種便攜、負(fù)擔(dān)得起且無需專業(yè)的診斷解決方案，能在半小時內(nèi)提供結(jié)果，相比于需要數(shù)小時到數(shù)天的PCR檢測，具有明顯優(yōu)勢。盡管LFA存在不足，但表現(xiàn)出 37.7% 至 99.2% 的靈敏度和超過 92% 的選擇性，超越了家庭自我診斷。然而，隨著LFA的普及，對其敏感性和選擇性的擔(dān)憂也在增加，假陰性和假陽性結(jié)果仍然是一個問題。
圖1.RT-PCR 與當(dāng)前 LFA 的比較
傳統(tǒng)提高LFA選擇性和靈敏度的方法可分為內(nèi)部和外部修飾，內(nèi)部修飾側(cè)重于改善 LFA 系統(tǒng)內(nèi)的化學(xué)相互作用，例如使用基于聚合物的 LFA 通過疏水效應(yīng)促進(jìn)蛋白質(zhì)接枝，實施 3D 生物接頭，通過增加表面積來減少空間位阻和控制流體流速，以及添加額外的共軛墊以允許多層納米顆粒 （NP） 共軛，從而增強(qiáng)比色信號強(qiáng)度。外部修飾主要針對信號或讀數(shù)的表達(dá)。包括：（i） 調(diào)整金納米顆粒 （AuNP） 的大小，（ii） 優(yōu)化接頭的長度，（iii） 應(yīng)用電活性標(biāo)簽，以及 （iv） 增強(qiáng)視覺信號。前兩種策略側(cè)重于放大表面等離子體共振 （SPR），而后兩種策略旨在改進(jìn)使用電信號、化學(xué)發(fā)光、比色法或量子點的檢測方法。此外，磁性可用于樣品定位和預(yù)濃縮。這些修改通常優(yōu)先考慮分析的進(jìn)步和樣品富集，相對于 PCR，LFA 的固有優(yōu)勢可能會受到影響，例如檢測時間短、檢測設(shè)計簡單和樣品預(yù)處理要求最低。傳統(tǒng)方法的主要目標(biāo)是提高結(jié)合效率，這是實現(xiàn)正確探針方向的結(jié)果。
抗體方向的修飾策略是膜工程和探針修飾。從本質(zhì)上講，固定化利用（生物）化學(xué)來最大限度地暴露有效結(jié)合位點，從而提高結(jié)合效率。無論是將探針錨定在納米顆粒、特定分析物還是測試和控制線上，定向固定都通過最大限度地暴露結(jié)合位點來確保安全和精確的結(jié)合。在這種情況下，LFA 保持了其檢測時間短、復(fù)雜性低和樣品預(yù)處理要求最低的標(biāo)志性特征。此外，由于捕獲-分析物復(fù)合物數(shù)量的增加，實現(xiàn)了更高的靈敏度或選擇性。雖然定向固定背后的理論看起來很簡單，但實際操作具有一定復(fù)雜性。在這些方法中誘導(dǎo)形成的化學(xué)鍵的能量較弱，對實現(xiàn)定向固定仍有一定困難。對于固定效率較高的方法，在費用、時間和精力方面成本可能較高。將蛋白質(zhì)作為助手是一把雙刃劍。一方面，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的特異性相互作用，適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)可以定向引導(dǎo)探針。另一方面，由于蛋白質(zhì)具有生物活性，因此必須仔細(xì)考慮環(huán)境條件、對靶標(biāo)的親和力以及與其他官能團(tuán)的交叉活性等因素。
實現(xiàn)高靈敏度和選擇性對于實現(xiàn)即時診斷的概念至關(guān)重要。目前，抗體固定方法可分為兩種主要類型：非共價修飾和共價修飾。無論采用何種原理，主要目標(biāo)是最大限度地提高結(jié)合位點的暴露，以最大限度地提高 LFA 的靈敏度和選擇性。當(dāng)抗體附著在 LFA 的膜表面時，可能會出現(xiàn)四種類型的排列。其中，“end on”方向被認(rèn)為更優(yōu)越，因為它更大程度地暴露了 Fab 片段上的結(jié)合位點，從而顯著提高了有效結(jié)合的可能性。因此，專注于調(diào)整抗體以實現(xiàn)末端定向的努力已成為一個重點。
圖2.抗體附著在 LFA 的膜表面四種類型的排列
實現(xiàn)抗體定向的方法多種多樣，其中物理吸附因其簡單直觀而最常用。物理吸附通過非共價相互作用，如疏水效應(yīng)、氫鍵、靜電相互作用和范德華力，利用探針、納米顆粒和平臺材料的表面特性來固定化抗體，而不顯著改變分子的電子結(jié)構(gòu)。然而，物理吸附形成的化學(xué)鍵較弱，導(dǎo)致抗體的固定不夠有效或定向。為了實現(xiàn)更精確和完全的抗體固定，已經(jīng)開發(fā)了多種修飾方法，可以分為探針修飾和膜修飾兩大類。探針修飾可以是非共價或共價的，取決于化學(xué)鍵的類型。而膜修飾則涉及測試線、控制線以及試紙底物成分的修改。
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探針修飾
1.1非共價鍵合
在 LFA 中，通常使用兩種彼此具有高親和力的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)定向固定。
圖3.LFA 中使用的蛋白質(zhì)之間非共價鍵的典型類型
蛋白 A、蛋白G 和蛋白 A/G 是廣泛用于固定某些免疫球蛋白的蛋白質(zhì)。Sotnikov 等人開發(fā)了一種基于常規(guī)類型的高級二期 LFA。在免疫層析血清學(xué)診斷初始階段利用金納米顆粒與葡萄球菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白 A 和固定在工作膜上的抗原偶聯(lián)。在后續(xù)階段，引入了一種標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合蛋白加強(qiáng)結(jié)合免疫復(fù)合物的著色。這種兩步法顯著減少了非特異性免疫球蛋白對檢測結(jié)果的干擾。使用 SARS-CoV-2 的重組 RBD 蛋白進(jìn)行測試，測試區(qū)著色強(qiáng)度增加了兩個數(shù)量級以上，假陰性結(jié)果顯著減少。LFA 的診斷敏感性從傳統(tǒng)格式的 62.5% 提高到增強(qiáng)格式的 100%。在 Kim 的研究中，對使用蛋白 G 將抗體定向固定在磁珠上與使用胺基隨機(jī)固定進(jìn)行比較。盡管定向固定化的偶聯(lián)物濃度較低，但在較高的靶標(biāo)濃度下觀察到更大的信號增強(qiáng)。這表明使用定向固定技術(shù)確實可以提高敏感性。除了直接應(yīng)用蛋白質(zhì) A 和蛋白質(zhì) G 外，還可以采用交聯(lián)技術(shù)。Choi 和他的團(tuán)隊對蛋白 G 進(jìn)行了基因工程改造，使其在 C 端包含兩個半胱氨酸殘基。這種修飾使半胱氨酸上的巰基能夠自組裝到金表面上，從而大大增強(qiáng)了金板的熒光性能。
圖4.蛋白 A 或蛋白 G 的幫助下進(jìn)行抗體定向固定。（A） 蛋白 A 促進(jìn)第二階段 LFA：（i） 擬議的增強(qiáng)型血清診斷 LFA 方案和 （ii） 含有 0 （1）、0.003 （2）、0.01 （3）、0.03 （4）、0.1 （5） 的樣品的普通（左圖）和增強(qiáng)（右圖）LFA 后的試紙照片， 0.3 （6）、1 （7）、3 （8） 和 10 （9） μg mL−1的 MAb RBD5313。（B） 以隨機(jī)（左）和定向（右）方式將抗體固定在磁珠上。（C-i）半胱氨酸修飾蛋白 G 將 IgG Fc 結(jié)合結(jié)構(gòu)域修飾和 IgG 固定在金表面的示意圖。（C-ii） 固定在 PBS 處理的金（左）、野生型蛋白質(zhì)處理（中）和半胱氨酸修飾的蛋白G 處理（右）金表面的 Cy3 標(biāo)記抗體的熒光顯微鏡分析。
1.1.2生物素-（strept）親和素相互作用
鏈霉親和素與捕獲探針預(yù)孵育可以導(dǎo)致鏈霉親和素復(fù)合物的多方向固定，這為生物素化檢測探針提供了結(jié)合位點。Nichols及其同事成功地應(yīng)用這種方法檢測了SARS-CoV-2。Wu的團(tuán)隊設(shè)計了一種基于BioAb/SA-BSA/MPA/AuNS/SPCE的免疫傳感器，專門用于檢測SARS-CoV-2。這項研究開發(fā)了一種基于無標(biāo)記電化學(xué)阻抗譜（EIS）的免疫傳感器，利用金納米結(jié)構(gòu)絲網(wǎng)印刷碳電極（AuNS/SPCE）來檢測唾液中的SARS-CoV-2核衣殼蛋白（N蛋白）。通過使用短鏈3-巰基丙酸（MPA）作為接頭，將鏈霉親和素（SA）和牛血清白蛋白（BSA）共價鍵合，以控制生物素化抗N蛋白抗體（BioAb）的定向固定化。展現(xiàn)出更高的靈敏度、更低的檢測限（LOD）和高度特異性。這表明通過使用BSA將抗體固定在各種材料上可以改進(jìn)病毒檢測的潛力。
圖5.在生物素-親和素相互作用的幫助下進(jìn)行抗體定向固定。（A-i）通過引入生物素-親和素化學(xué)技術(shù)開發(fā)半條帶 LFA，用于檢測 SARS-CoV-2。（A-ii）通過使用從 Genemedi 和 Genscript 獲得的兩種市售 SARS-CoV-2 核衣殼 （N） 蛋白，為半條帶 LFA 生成的劑量-反應(yīng)曲線。（B-i）顯示基于 AuNS/SCPE 的免疫傳感器制造的步驟，包括用 MPA 修飾 AuNS/SPCE、用EDC/NHS 激活、SA-BSA 的固定化、BioAb 的固定化，最后是 N 蛋白免疫反應(yīng)。（B-ii）BioAb/SA-BSA/MPA/SPCEs對各種分析物的特異性性能。
為了提高定向固定化效率，利用抗體上存在的特定官能團(tuán)如胺基，羧基，二硫鍵，和Fc 區(qū)鉸鏈結(jié)構(gòu)域中的可修飾碳水化合物部分。與物理吸附相比，共價鍵固定化方法具有優(yōu)異的鍵強(qiáng)度，從而提高了固定化效果。
圖6.調(diào)節(jié)抗體方向的共價鍵策略。（A） 抗體結(jié)構(gòu)和功能性 Fc 和 Fab 區(qū)域?？贵w和探針之間的共價鍵合反應(yīng)，包括 （B） 羧酸-胺、（C） 二硫鍵裂解和 （D） 碳水化合物反應(yīng)。
1.2.1胺和羧基官能團(tuán)之間的偶聯(lián)
最常用的方法包括通過 EDC/NHS 偶聯(lián)形成酰胺鍵。有團(tuán)隊通過 EDC/NHS 成功實現(xiàn)了抗體與 AIE 發(fā)光原 （AIEgens） 的偶聯(lián)，從而能夠目視檢測 SARS-CoV-2 的受體結(jié)合域 （RBD） 和 N 抗原。該方法的檢測限較低，低至 6.9 ng mL−1用于 RBD 蛋白和 7.2 ng mL−1對于具有高特異性的 N 蛋白。Chan 的小組使用與4,7,10-三氧雜-1,13-十三烷二胺（一種靈活的二胺-PEG接頭）作為接頭，將聚合物與抗體偶聯(lián)，抗體可以定位與靶抗原結(jié)構(gòu)域?qū)R，特異性結(jié)合親和力顯著增加。
圖7.在胺基和羧基的幫助下改變抗體方向。（A-i）基于 AIEgen 的試紙的配置和檢測機(jī)制示意圖。（A-ii）0、0.001、0.01、0.1、1、10 和 20 μg mL 試紙在 365 nm 光照射下的試紙圖像−1PBS 中的 RBD（左）和 N（中）蛋白。右圖：與含有 1 μg mL不同抗原（AFP、HCG、CEA、CA125、HSA、S2 蛋白、RBD 蛋白、FBS、CRP 和 N 蛋白）的樣品反應(yīng)后，試紙在 365 nm 光照射下的圖像−1).（B-i）示意圖顯示了在探針表面實現(xiàn)抗體功能化的傳統(tǒng)方法。（B-ii）修飾二胺作為探針表面和抗體之間的接頭。底部面板顯示了與含有 0 或 5 ng mL 的樣品反應(yīng)后的試紙照片−1的 PSA 抗原。
存在于抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵也可以促進(jìn)固定。Jeong 等人通過馬來酰亞胺偶聯(lián)，使抗體與硅納米顆粒的結(jié)合增加了大約 8 倍。由于實現(xiàn)了適當(dāng)?shù)亩ㄏ?，巰基固定化抗體的使用表現(xiàn)出卓越的特異性靶向能力。例如，使用雙金偶聯(lián)物開發(fā)了唾液樣本中 SARS-CoV-2 刺突 1 （S1） 抗原的快速檢測平臺，以增強(qiáng)信號。在這項研究中，金標(biāo)記的抗 S1 納米抗體 （Nbs） 作為 S1 檢測器偶聯(lián)物，而金標(biāo)記的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2 （ACE2） 作為 S1 捕獲偶聯(lián)物（圖4A）。在循環(huán)閾值 （Ct ≤ 30） 的陽性樣本的早期檢測中，與 mAb 基試紙條相比，基于 Nbs 的LFT 試紙條表現(xiàn)出更高的靈敏度 （97.14%） 和特異性 （98.57%）（圖 4B），為在易于收集的唾液樣本中快速篩查 SARS-CoV-2 S1 抗原提供了靈敏的診斷工具。
圖8.（A） 示意圖說明了用于檢測唾液樣本中 SARS-CoV-2 S1 抗原的增強(qiáng)型夾心 LFA。（B） 使用 Nbs 或 mAb 的增強(qiáng)型 LFA 試紙條中的顏色強(qiáng)度與唾液樣本中病毒拷貝數(shù)之間的關(guān)系。
Daniele 和 Menegatti的小組通過碳水化合物固定實現(xiàn)了信號放大，這種通過 Fc 碳水化合物基團(tuán)的位點特異性方法降低了偶聯(lián)異質(zhì)性，并增加了正確定向 IgG 檢測器偶聯(lián)物的可能性。Lin 等人使用環(huán)狀硼酸二酯與捕獲抗體上的碳水化合物定向結(jié)合，用于凝集素檢測，構(gòu)建了一個微陣列平臺。銀增強(qiáng)圖像表明，以定向方式固定的抗體微陣列產(chǎn)生了清晰且均勻的陣列?？贵w在微陣列上的定向顯著提高了檢測靈敏度。與隨機(jī) NHS 化學(xué)固定化獲得的檢測結(jié)果相比，檢測結(jié)果明顯更亮，說明了抗體定向的重要性。
圖9.在碳水化合物的幫助下進(jìn)行抗體定向固定。（A-i）示意圖顯示了以量子點作為信號報告基因的側(cè)向?qū)游鰥A心免疫測定?？贵w和量子點之間通過碳水化合物基團(tuán)的偶聯(lián)是通過氧化抗體 Fc 區(qū)的糖基化區(qū)域來實現(xiàn)的。（A-ii）普通 EDC 偶聯(lián)和碳水化合物氧化后還原胺化對分析物的信號響應(yīng)比較。（B-i）用于凝集素傳感測定的基于糖納米顆粒的定向抗體微陣列的示意圖。（B-ii）通過硼酸鹽形成定向固定和隨機(jī)酰胺鍵形成制備的捕獲抗體之間的檢測性能比較。
除了用于抗體定向的探針修飾外，與探針相比，促進(jìn)毛細(xì)管效應(yīng)的膜經(jīng)常被忽視。LFA 膜的結(jié)構(gòu)包括硝酸纖維素膜和涂層測試/對照線，其中兩種組合物也可以進(jìn)行定向修飾。這類技術(shù)包括成熟的蛋白質(zhì)預(yù)包被和新開發(fā)的纖維素材料。
2.1測試線和控制線的修飾
蛋白A和蛋白G不僅可以與抗體探針偶聯(lián)，還能用于修飾檢測線和控制線，結(jié)合位點朝外，以提高靈敏度。在實驗中，使用蛋白G預(yù)包被的檢測線能夠有效捕獲抗體復(fù)合物，并在高樣品稀釋下保持良好檢測限。Cai 等人用蛋白 G 預(yù)包被測試線，當(dāng)抗原存在時，能夠定向捕獲抗 rSjSAP4 抗體復(fù)合物。該設(shè)備表現(xiàn)出令人滿意的檢測限，即使在 320 倍樣品稀釋下，R 值仍保持在 1 以上。但在高濃度血清樣品中，非特異性抗體結(jié)合可能導(dǎo)致結(jié)果降低。
圖11.（A） 使用預(yù)包被的重組蛋白 G 修飾測試線，用于定向抗體固定。（B） 稀釋液的檢測限范圍為 1：5至 1：40690，通過引入 Kato Katz 陽性參與者的混合血清樣品。據(jù)報道，檢出限為 1：20480。C：控制線;T：測試線;NC，來自非流行對照的混合血清樣品，以 1：5的稀釋度測試。
鏈霉親和素或生物素作為捕獲探針直接包被在檢測線上，能有效增強(qiáng)LFA的性能。與傳統(tǒng)LFA相比，這種方法提供了更長的保質(zhì)期、增強(qiáng)的信號及識別DNA和RNA序列的能力。此外，鏈霉親和素預(yù)包被的條帶還可以定向固定生物素化的納米抗體（Nbs），后者相較于傳統(tǒng)抗體更小，降低了無定向結(jié)合的風(fēng)險，同時具有更好的抗熱和化學(xué)變性能力。Magez團(tuán)隊利用生物素化的納米抗體開發(fā)了針對剛果錐蟲的LFA，發(fā)現(xiàn)與鏈霉親和素包被的測試線結(jié)合的性能優(yōu)于直接沉積的納米抗體。在優(yōu)化分析緩沖液后，靈敏度得到了顯著提高。盡管LFA在小鼠和牛的測試中表現(xiàn)出一定的假陰性率，研究者們提出使用帶有 AuNP （Nb44–Nb44–AuNPs） 的二價捕獲納米抗體來增強(qiáng)親和力和信號放大，有望克服這一局限性。
圖12.（A） 針對剛果錐蟲的基于 Nb 的 LFA 的設(shè)計。（B） 加標(biāo) PBS 的檢測限 TcoPYK：Nb42 包被測試線 （0.88 μg ml−1，左）和生物素化 Nb42 包被的測試線 （0.22 μg ml−1，右）。（C） 加標(biāo)稀釋系列 TcoPYK 的幼稚牛血清的檢測限：使用單價 Nb44-AuNPs（0.88 μg ml−1，左）和二價 Nb44–Nb44–AuNPs（0.11 μg ml−1，右）作為捕獲抗體。
核酸的固定化通常使用生物素、鏈霉親和素或蛋白A和蛋白G等方法，這些間接方法需額外的預(yù)孵育步驟，影響成本效益和時間效率。在Bruylants的研究中，使用BSA固定的p14肽適配體成功檢測癌癥生物標(biāo)志物Mdm2，表現(xiàn)出比傳統(tǒng)抗體系統(tǒng)更高的靈敏度和穩(wěn)定性。此外，開發(fā)的自組裝四面體DNA納米結(jié)構(gòu)（TDN）提高了固定探針的方向性和密度，減少了空間位阻。Zuo等人利用TDN開發(fā)的金電極平臺顯著提高了對PSA的檢測限，歸因于適當(dāng)?shù)奶结橀g距。TDN還被用于側(cè)向?qū)游鲈嚰?，能夠有效檢測外泌體miRNA-150-5p，顯示出良好的靈敏度和選擇性。盡管TDN技術(shù)具有潛力，但仍需簡化探針制造程序以實現(xiàn)真正的POC工具。
圖13.（A） 基于靶向外泌體 vmicroRNA-150-5p 的 DNA 四面體包被條帶的比率式 LFA 設(shè)計。（B） 應(yīng)用 0、10 進(jìn)行靈敏度測試−13, 10−12, 10−11, 10−10, 10−9和 10−8miR-150-5p 的 M（左）。LOD 為 0.9921，基于靈敏度測試的數(shù)據(jù)（右）得出。（C） 通過引入 miR-150-5p、單堿基錯配 miR-150-5p、雙堿基錯配 miR-150-5p、隨機(jī) miRNA 和 miR-21 進(jìn)行選擇性檢測（相應(yīng)地是 b-f 組。組 a 為空）（左）。當(dāng)用 miR-150-5p 處理時，比率裝置的 T/C 比值顯著升高，b 組 （右）。
2.1.4兩親性疏水素 （HFBI） 蛋白
抗體在多孔硝酸纖維素膜測試線上的生物活性對分析靈敏度至關(guān)重要。傳統(tǒng)的噴涂方法常導(dǎo)致抗體隨機(jī)取向和多層疊加，損失生物活性。Zhang等人采用了兩親性疏水素（HFBI）來促進(jìn)PSA抗體的有序自組裝，確?？贵w以“立式”取向固定在測試線。該方法的檢測限低至0.06 ng/mL，比傳統(tǒng)方法提高了靈敏度，并獲得了良好的校準(zhǔn)曲線（決定系數(shù)0.965）。特異性測試顯示，僅在PSA組中有顯著熒光信號。HFBI修飾的LFA在150份臨床血清樣本中的檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光免疫測定一致，驗證了其準(zhǔn)確性。
圖14.（A） 傳統(tǒng)和HFBI 修飾的 LFA 的示意圖比較。（B） 用于檢測 PSA 靶標(biāo)的 HFBI 修飾和未修飾FICT 的 LOD（左上）。敏感性測試（左下）：通過處理 0、0.2、1、2、5 和 12 ng mL 的 PSA 靶標(biāo)，目視讀取 HFBI 修飾的 FICTS−1分別。選擇性試驗（右）：HFBI 修飾的 LFA 與不同抗原反應(yīng)后。
2.2膜的改性
為了改善方向控制，已經(jīng)引入了基于纖維素的 LFA。纖維素基材（例如濾紙、棉纖維和纖維素纖維）具有更高的柱床體積和更強(qiáng)的非特異性結(jié)合抵抗力，從而提高了靈敏度。碳水化合物結(jié)合模塊 （CBM） 是在許多碳水化合物活性酶中發(fā)現(xiàn)的不同蛋白質(zhì)片段，它們能夠結(jié)合多種碳水化合物，從二糖和低聚糖到纖維素等多糖，具有高選擇性和特異性。França Prazeres 的小組首先制備了一種傳統(tǒng)的 LFA 形式，它依賴于捕獲抗體在 NC 膜測試線上的隨機(jī)吸附，與由 ZZ-CBM3 融合修飾的 LFA 進(jìn)行比較。結(jié)果表明，當(dāng)使用纖維素作為涂層時，熒光線通常更粗、更強(qiáng)烈，并顯示出更大的像素體積。這種線粗增加歸因于生物素-BSA 溶液在纖維素層上的橫向擴(kuò)散增強(qiáng)，證實了纖維素涂層有效地作為 ZZ-CBM3 融合的錨點。另一項實驗比較了在 LFA 測試線上分配蛋白 A 和ZZ-CBM3 融合對 Alexa 標(biāo)記抗體的捕獲能力。在 NC + 纖維素條帶中觀察到的 ZZ-CBM3 融合強(qiáng)度更高，這可歸因于 ZZ 結(jié)構(gòu)域在融合中提供的更有利的方向。
圖15.（A） 傳統(tǒng)NC 膜與在 LFA 中涂覆 ZZ-CBM 熔融膜的比較。（B-i）NC 條帶上的纖維素涂層對生成信號的熒光強(qiáng)度的影響。（B-ii）在 LFA 測試線上通過蛋白A 和 ZZ-CBM3 融合對 Alexa 標(biāo)記抗體的捕獲效率進(jìn)行比較。實驗在測試線上使用 NC 條帶和添加纖維素層 （NC + cel） 的 NC 條帶。
Kolmar 和Schwall 等人開發(fā)了單鏈可變片段 （scFv） 或全長抗體 （IgG） 與來自熱梭菌纖維素骨架支架的 CBM3a 結(jié)構(gòu)域的遺傳融合。這種方法顯著提高了纖維素結(jié)合載量，與使用裸 scFvs 或 IgG 的側(cè)向?qū)游鲅b置相比，該方法提高了基于纖維素的側(cè)向?qū)游鲅b置的靈敏度和整體性能。
圖16.（A） 使用毛細(xì)管流速約為 60 s/4 cm （C60） 的纖維素紙檢測 hCG 的纖維素基 LFA。使用CBM 抗 hCG scFv 或單獨抗 hCG scFv 修飾測試線。（B） 用于檢測血清樣品中 SARS-CoV-2 特異性抗體的纖維素基 LFA，檢測線涂有 CBM-抗-Fc scFv、抗 hIgG-CBM、抗 Fc scFv 或抗 hIgG 作為檢測抗體。
Kim 的小組開發(fā)了一個比色 LFA 平臺，用于使用雙功能融合接頭 CBP31-BC 進(jìn)行早期 SARS-CoV-2 檢測。該接頭結(jié)合了纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)和抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以將抗體定向到纖維素膜上。測試區(qū)的特點是在測試線上將 CBP31-BC 與抗 SARS-CoV-2 RBD 抗體預(yù)孵育，在對照線上單獨使用 CBP31-BC。將 CBP31-BC 與捕獲抗體的最佳摩爾比確定為 1：20，以最大限度地減少檢測抗體在金納米顆粒上的非特異性吸附?；?CBP31-BC 的 LFA 使用來自 SARS-CoV、MERS-CoV和 CoV-H229E 的 S1 抗原對 SARS-CoV-2 抗原表現(xiàn)出高度特異性。該平臺的實用能力使用培養(yǎng)的SARS-CoV-2 樣本進(jìn)行評估，顯示視覺敏感性和 5 × 10 的 LOD5每毫升拷貝數(shù)。此外，使用 COVID-19 患者 （n = 16） 和健康受試者 （n = 3） 的鼻咽拭子樣本證實了 LFA 的性能，顯示出與 RT-qPCR 結(jié)果的高度一致性。
圖17.（A） 用于檢測 SARS-CoV-2 的基于 CBP31-BC 的 LFA 示意圖。（B）SARS-CoV-2 RBD、SARS-CoV S1、MERS-CoV S1 和 CoV-H229E S1 抗原的 LFIA 標(biāo)準(zhǔn)化測試線強(qiáng)度，虛線表示無樣品。（C） 各種培養(yǎng)的 SARS-CoV-2 濃度的 LFA 試紙的攝影圖像和歸一化測試線強(qiáng)度，黑色虛線表示臨界值（3 個空白樣品的平均值 + 3 個標(biāo)準(zhǔn)差）。（D） 使用COVID-19 患者的鼻咽拭子樣本與 PCR 結(jié)果的 LFA 性能比較。
但是在以上方法中仍然存在一些問題，例如蛋白質(zhì)之間交叉反應(yīng)性引起的定向固定化減少，生物識別蛋白結(jié)構(gòu)域可能與其他抗體片段結(jié)合或與非靶標(biāo)分析物反應(yīng)，纖維素膜上熒光在測試線和對照線上的擴(kuò)散等等，這些問題仍有待解決。
2.2.2纖維素納米纖維改性生產(chǎn)線
近年來，在 LFA 中添加纖維素納米纖維 （CNF） 層已成為一種旨在提高靈敏度的成熟技術(shù)。CNF 具有較小的孔徑，可增強(qiáng)孔隙率、表面積和暴露的羥基數(shù)量，間接提高了靈敏度。然而，這種方法主要依賴于物理吸附，與 CBM 融合策略相比，物理吸附對抗體固定的效果較差。此外，CNF 產(chǎn)生的致密表面會阻礙樣品遷移，從而降低重現(xiàn)性。Merkoçi 的小組發(fā)現(xiàn)，CNF 凝膠增加了紙張表面附近抗體的密度，從而通過在陽性樣品上保留更多報告探針來增強(qiáng)信號。CNF 用于穿透硝酸纖維素紙的孔隙，僅減小測試區(qū)域的孔徑，增加了測試線區(qū)域中選擇性連接的金納米顆粒的密度，并將靈敏度平均提高了 36.6%。這種改性簡單、經(jīng)濟(jì)高效，并且可以輕松應(yīng)用于任何類型的 LFA 試紙條，使其適用于即時應(yīng)用。
圖18. (A） 未改性的陽性測試線（上圖）和分配纖維素納米纖維改性的陽性測試線的示意圖（下圖）。Merkoçi 教授通過引入纖維素納米纖維的 LFA。（B） 在測試線上應(yīng)用和不應(yīng)用 CNF 的LFA 的攝影圖像（上圖），HIgG 為 0、0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75 和 1.00 μg ml−1.條形圖（下圖）用于比較信號增強(qiáng)的百分比。
【小結(jié)】
在側(cè)向流檢測（LFA）中提升靈敏度和選擇性至關(guān)重要，重點是抗體定向固定。包括物理調(diào)整、共價鍵形成、非共價鍵形成、纖維素基膜和纖維素納米纖維涂層。傳統(tǒng)方法（如物理調(diào)整和共價鍵形成）存在交互作用弱和操作復(fù)雜的問題，而非共價鍵形成雖具有生化特異性，但面臨蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)性等困難。較新的CBM主導(dǎo)的生物識別方法也存在類似問題。此外，纖維素涂層能增強(qiáng)信號強(qiáng)度，但仍存在線路擴(kuò)散和無方向固定的挑戰(zhàn)。
除了討論的常規(guī)和新型固定技術(shù)外，將捕獲探針連接、存放或涂覆到 T/C 線上的方法也經(jīng)常被忽視。本文旨在解決和改進(jìn)噴涂過程中導(dǎo)致的隨機(jī)固定，如果檢測線本身在其組合中沒有正確定向，則后續(xù)捕獲和識別探針層也將缺乏正確的方向。總之，盡管迄今為止開發(fā)了許多技術(shù)，但沒有一項技術(shù)完全達(dá)到理想的 POC 標(biāo)準(zhǔn)。LFA 在靈敏度和選擇性方面仍有很大的改進(jìn)空間。此外，成本和全球可用性是減輕經(jīng)濟(jì)和人員負(fù)擔(dān)需要關(guān)注的關(guān)鍵因素。因此，化學(xué)工程、聚變技術(shù)和生物分子探索方面的進(jìn)步是需要進(jìn)一步努力和研究的領(lǐng)域。
Lu Z Y, Chan Y H. The importance of antibody orientation for enhancing sensitivity and selectivity in lateral flow immunoassays[J]. Sensors & Diagnostics, 2024.
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/D4SD00206G
