【摘要】

　　金黃色葡萄球菌(S. aureus)是對公眾健康最普遍的威脅之一。具有高靈敏度的快速檢測和有針對性的殺傷對于遏制其傳播至關重要。本文中，構建了一種含金屬的納米復合材料，由雙金屬納米顆粒和金屬有機框架(Au/Ir@Cu/Zn-MOF)構成。在與抗-S. aureus抗體(Ab)結合時，這種納米復合材料(Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF)具有雙重功能，即作為側流免疫測定中的報告探針和高效抗菌試劑。得益于Cu/Zn-MOF對Au/Ir納米顆粒(nanoparticles，NPs)的富集，基于Au/Ir@Cu/Zn-MOF的側流免疫測定傳感器顯示出103CFU/mL的視覺檢測極限，其靈敏度是基于Au/Ir的傳感器的100倍。此外，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針具有協(xié)同的光熱和化學動力學殺菌作用，特異性靶向S. aureus。在H2O2(0.4 mM)和808 nm近紅外輻射(1 W/cm2，5 min)的共同處理下，在納米復合材料濃度低至6.25 μg/mL時，實現(xiàn)了對5×105-106CFU/mLS. aureus的完全滅菌。優(yōu)異的抗菌效果歸因于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針的三重特性：(1)增強了促進活性氧生成的多酶模擬活性，(2)高光熱活性(效率為53.70%)，以及(3)通過抗體涂層靶向細菌的能力。通過改變抗體，這種納米復合材料可以針對廣泛的細菌種類進行定制，用于檢測和精確的抗菌治療。

【引言】

　　傳統(tǒng)的基于金納米顆粒(Au NPs)的側流免疫分析(LIFA)作為傳感材料的靈敏度不令人滿意。例如，預包裝食品(乳制品、肉制品、冷凍飲料等)中S. aureus的最高安全限量103CFU/mL(GB 29921-2021)，對于使用Au NPs的S. aureus的視覺LFIA，檢測限(LOD)約為106CFU/mL，不足以進行食品安全監(jiān)管。近年來，雙金屬NPs由于其模擬酶的活性和突出的光學性質，成為LFIA中備受追捧的信號探針。例如，我們小組創(chuàng)建了基于Au@Ru雙金屬納米復合材料的LIFA用于快速靈敏地檢測鼠傷寒沙門氏菌，LOD為9.8×104CFU/ml。R. Zhang等人(2021)建立了雙拉曼分子標記的Au@Ag核殼納米顆粒用于快速、超靈敏和定量地檢測糞便中的輪狀病毒。然而，據我們所知，很少有基于雙金屬納米粒子的LFIA用于檢測金黃色葡萄球菌的相關研究報告。

　　為了控制細菌污染和細菌感染，應在識別出存在的細菌后立即進行有效的殺滅和治療。為了解決抗生素耐藥性問題，已經開發(fā)了多種新興的抗菌療法，如基于局部溫度升高的光熱療法(PTT)、基于模擬酶活性產生活性氧(ROS)的化學動力學療法(CDT)，通過光催化產生ROS的光動力療法(PDT)等。這些策略可以單獨用作單?？咕呗?，另一方面，開發(fā)利用多模式策略的協(xié)同抗菌策略可以產生更有效的抗菌效果。在各種協(xié)同策略中，PTT和CDT的組合已被廣泛研究。盡管基于納米材料的PTT-CDT策略具有很高的有效性，但在正常情況下，PTT和CDT效應產生的熱量和ROS也會對周圍的正常組織和細胞造成損傷。因此，對特定細菌物種的選擇性靶向是十分重要的。已知抗體可特異性識別細菌細胞并與細菌細胞緊密結合。抗體結合的抗菌納米材料不僅減少了對正常組織和細胞的損傷，抗體與細胞表面基序的結合還縮短了抗菌材料與細菌之間的距離，從而增強了抗菌效果，因而利用抗體修飾納米復合材料開發(fā)精確的PTT-CDT協(xié)同抗菌平臺具有廣闊的前景。

　　已知大多數納米顆粒易于聚集，這可能會削弱或失去其所需的膠體性質。另一方面，良好分散的納米顆粒在用作傳感探針時具有有限的信號強度，因此靈敏度有限。金屬有機框架(MOFs)是一類具有多孔結構的材料。MOFs由于其高比表面積和較大的負載能力，已被廣泛用作各種物質(如酶、抗菌藥物等)的支撐基質。通過物理吸附或共沉淀將納米顆粒裝載到MOFs中有望避免不必要的聚集，同時有助于濃縮納米顆粒。當抗體配體與nanoparticle@MOF結合形成Ab-nanoparticle@MOF探針，將導致LFIA試條上的信號強度增強，從而提高細菌檢測的靈敏度和靶向細菌的能力。

　　在本工作中，通過還原合成了Au/Ir雙金屬納米顆粒(Au/Ir NPs)，然后通過共沉淀將其負載到Cu/Zn-MOF中以獲得Au/Ir@Cu/Zn-MOF復合材料。接下來，將復合物與抗-S. aureus抗體(Ab)偶聯(lián)。利用靜電相互作用制備了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針，并建立LFIA傳感器，用于檢測S. aureus和精確的光熱-化學動力學(PTT-CDT)協(xié)同抗菌處理(Fig. 1)。以MOF的對應物Au/Ir NPs為參考，來證明Cu/Zn-MOF富集Au/Ir NPs的重要性，從而將用于S. aureus檢測的Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LIFA的靈敏度提高了100倍，其靈敏度是傳統(tǒng)Au NPs-LIFA的1000倍。此外，測試了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針對S. aureus的精確PTT-CDT協(xié)同殺菌作用，顯示出優(yōu)異的性能。進行了詳細的實驗來證實該探針具有優(yōu)異的光熱轉換能力和ROS產生能力，以及良好的基于抗體的細菌靶向能力?？傮w而言，本研究開發(fā)的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針是一種雙功能納米復合材料，適用于S. aureus的快速檢測和高效殺菌。

　　Fig. 1(a)Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針的合成示意圖，(b)基于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針的細菌側流免疫測定，以及(c)Ab-Au/Ir@Cu/ZnMOF探針的抗菌應用和抗菌機制(Ab靶向/光熱療法(PTT)/化學動力學療法(CDT))。

【研究內容】

1.基于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針制備的LFIA傳感器

　　為實現(xiàn)特異性側流免疫測定和對細菌的精確抗菌，通過靜電相互作用將抗-S. aureusIgG(Ab)與Au/Ir@Cu/Zn-MOF復合材料結合。通過Zeta電位證實了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針的成功制備，詳細討論在“支持信息”中進行了描述。此外，每個Au/Ir@Cu/Zn-MOF納米復合材料的共軛Abs的數量通過使用Bradford測定法，測量結合前后抗-S. aureusIgG溶液的濃度變化來測定。利用這種Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針，設計了競爭性橫向流動測試(Fig. 1b)，其中測試線(T線)涂有S. aureus，對照線(C線)用山羊抗兔IgG包被。當樣品不含S. aureus時，在偶聯(lián)物墊中噴灑的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針可以與T線(通過抗體和S. aureus相互作用)和C線(通過兔IgG和抗兔IgG相互作用)結合，從而導致T線和C線顯色。相反，當樣品含有S. aureus時，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針優(yōu)先與樣品中的S. aureus結合，使金黃色葡萄菌在T線上捕獲的數量減少，表現(xiàn)為T線減輕。此類樣品S. aureus/Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針復合物不會影響C線強度，因為C線捕獲了所有已結合或未結合S. aureus的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針。因此，可以根據T線的顏色變化直觀快速地檢測樣品中S. aureus的濃度。

2.使用構建的LFIA條帶檢測S. aureus

通過制備參數的優(yōu)化，制備了用于S. aureus檢測的LFIA條帶。如Fig. 2a所示，隨著樣品中S. aureus濃度的增加，T線的顏色逐漸變淺。當S. aureus的濃度增加到103CFU/mL時，它明顯比空白組顏色更淺，表明其vLOD為103 CFU/mL。其qLOD經計算為3.39×102CFU/mL，T線的顏色強度與S. aureus濃度的對數在101-105CFU/mL范圍內線性相關，R2為0.983(Fig. 2b)。為了證實Cu/Zn-MOF在增強探針強度和LFIA靈敏度方面的作用，構建了基于Au/Ir的LIFA條帶進行比較。從Fig. 2c和Fig. 2d可以發(fā)現(xiàn)，基于Au/Ir的LIFA條帶的vLOD和qLOD分別為105CFU/mL和3.66×104CFU/mL，比Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LIFA傳感器的靈敏度低近100倍。較高的靈敏度可歸因于Cu/Zn-MOF在Au/Ir NPs富集中的作用，導致條帶上較高的顏色強度。其次，Au/Ir@Cu/Zn-MOF的Zeta電位比Au/Ir更低，以及明顯更大的尺寸(Fig. S1a)都導致Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針中有更多的抗體涂層，這有助于進一步增強其靈敏度。這可以從Fig. S4c中得到初步驗證，Ab貢獻的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針的Zeta電位(14.75 mV)顯著高于Ab-Au/Ir探針(3.66 mV)。此外，通過Ab濃度變化測量(Bradford測定法)每個Au/Ir NPs綴合的Abs數量為147±27，顯著低于每個Au/Ir@Cu/Zn-MOF納米復合材料綴合的數量(566±31)，也進一步證實了上述結果。

　　此外，為了評估儲存穩(wěn)定性，我們測試了Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA傳感器在4 ℃的vLOD，獲得的vLOD同樣為103CFU/mL(Fig. S7a)，表明本工作中制備的LFIA傳感器具有可接受的儲存穩(wěn)定性。除了靈敏度和儲存穩(wěn)定性檢測外，還評估了Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LIFA傳感器用于S. aureus檢測的特異性。從Fig. S7b可以看出，只有S. aureus(107CFU/mL)和混合組能夠使T線的顏色從條帶上消失，而單獨的其他6種干擾細菌則不能，甚至它們的濃度都是S. aureus的100倍，可滿足對目標S. aureus進行特異性鑒定的基本要求。

　　Fig. 2 LFIA傳感器用于檢測S. aureus。(a)基于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA傳感器檢測磷酸鹽緩沖液(PBS)中的S. aureus的結果，(b)使用Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF- LFIA傳感器檢測S. aureus的定量結果和校準曲線，(c)基于Ab-Au/Ir-LFIA傳感器在PBS中檢測S. aureus的結果，(d)使用基于Ab-Au/Ir-LFIA的S. aureus檢測的定量結果。(b)和(d)中的誤差條表示3次測定的標準偏差。

3.在真實樣品中檢測S. aureus

　　為了探索所建立的Au/Ir@Cu/Zn MOF-LIFA傳感器在實際樣品分析中的可行性，將S. aureus添加到不同領域的真實樣品中，包括食品樣品(維他奶和橙汁)和水環(huán)境樣品(珠江水)。如Fig. 3所示，隨著S. aureus濃度的增加，T線上的信號強度逐漸減弱，這表明LIFA傳感器在實際樣品檢測中仍然對S. aureus反應靈敏。

　　它們的vLOD均為103CFU/mL，與PBS系統(tǒng)中的相同。該vLOD可達到食品中S. aureus的最高安全限值(103CFU/mL)(GB 29921-2021)。此外，該LIFA傳感器在實際樣品中檢測S. aureus的準確性也通過回收試驗進行了評估。結果顯示(Table S3)，加標S. aureus的平均回收率在89.87%-105.84%之間，相對標準偏差(RSD)值不超過5.68%。這樣的準確度水平，使得該LFIA傳感器在實際樣品中顯示出良好的現(xiàn)場檢測金黃色葡萄菌的潛力。

　　Fig. 3 Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA傳感器檢測實際樣品中的S. aureus。(a)維他奶、(b)橙汁和(c)珠江水。

4. Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針的體外協(xié)同抗菌作用及儲存穩(wěn)定性

　　鑒于本工作中獲得的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針不僅具有優(yōu)異的光熱性能并且憑借其多酶模擬活性具有ROS產生能力，而且還通過偶聯(lián)抗-S. aureusIgG，具有精確的光熱-化學動力學(PTT-CDT)協(xié)同抗菌治療的潛力。于是，研究了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針對S. aureus的體外功效。

　　從Fig.4和Fig. S14a可以發(fā)現(xiàn)，在沒有808 nm近紅外光照射和H2O2的情況下，純Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針即使在200 μg/mL的高濃度下，也只能殺死約39.84%的細菌。然而，當向系統(tǒng)中加入0.4 mM H2O2時(該濃度接近細菌感染傷口中測得的量，即0.1-0.25 mM，遠低于傷口消毒常用的量，如100-1000 mM)，或用808 nm近紅外光照射5 min，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針在濃度分別為100 μg/mL和50 μg/mL時可完全滅活細菌。更令人驚訝的是，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針在低至6.25 μg/mL的濃度下，經H2O2和808 nm近紅外光共同處理，可達到100%的殺菌效果。殺菌效果分別是單獨用H2O2或808 nm近紅外光處理的殺菌效果的16倍和8倍。這要歸功于Au/Ir@Cu/Zn-MOF復合材料優(yōu)異的光熱性能和多酶模擬活性。此外，還可以發(fā)現(xiàn)無Ab偶聯(lián)的Au/Ir@Cu/Zn-MOF復合材料在H2O2和808 nm近紅外光共處理下的完全殺菌濃度為25 μg/mL，比Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針高4倍。這是由于Ab對Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針的細菌靶向作用，可以使得Au/Ir@Cu/Zn-MOF復合物更接近細菌，使產生的ROS和局部高溫能更有效地殺滅細菌。一般來說，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針通過其Ab靶向能力、多酶模擬活性和光熱性能，可以實現(xiàn)精確的協(xié)同高效抗菌效果。此外，從Fig. S14b中可以發(fā)現(xiàn)，6.25 μg/mL Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針在4 ℃長達14天，這表明本工作中制備的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針具有可接受的儲存穩(wěn)定性。

　　Fig. 4S. aureus(ATCC 6538)與不同濃度的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針或Au/Ir@Cu/Zn-MOF復合材料在存在或不存在0.4 mM H2O2和/或808 nm激光照射(1 W/cm2)的情況下于37 ℃中共同孵育24 h后的菌落照片。

【結論】

　　本研究成功制備了由雙金屬NPs(Au/Ir)和Cu/Zn-MOF組成的雙功能金屬納米復合材料，用于S. aureus的快速靈敏側流免疫分析(LFIA)和體外精確光熱-化學動力學協(xié)同抗菌治療。由于Cu/Zn-MOF富集Au/Ir NPs，開發(fā)的Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA傳感器能夠實現(xiàn)對S. aureus的高靈敏度檢測，視覺檢測限為103CFU/mL，比基于Au/Ir的LIFA傳感器低100倍。此外，該傳感器在實際樣品中檢測S. aureus時也表現(xiàn)出足夠的特異性、可行性和準確性。得益于優(yōu)異的光熱性能和多酶模擬活性(過氧化物酶-過氧化氫酶-氧化酶模擬活性)，以及抗體的細菌靶向作用，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針可以在體外實現(xiàn)精確的光熱-化學動力學協(xié)同抗菌效果。在H2O2和808 nm近紅外激光的共同作用下，納米復合材料在6.25 μg/mL的低濃度下完全滅活細菌。

　　然而，值得注意的是，當應用于治療細菌感染時，這種Ab綴合的Au/Ir@Cu/Zn-MOF探針(通過物理吸收制備)可能受到細菌環(huán)境中復雜生物介質的影響，導致Ab從Au/Ir@Cu/Zn-MOF上脫落，從而失去其細菌靶向功能。為此，設想將探針結合到多孔水凝膠中(制作水凝膠敷料或軟膏等)，不僅可以預防Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF在復雜的生物介質中不會散開，還能去除用過的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF和死細菌細胞，降低納米材料對生物體的潛在毒性和炎癥的發(fā)生率。

【原文出處】

　　Zhong, Y., Zheng, X. T., Li, Q. L., Loh, X. J., Su, X., & Zhao, S. (2023). Antibody conjugated Au/Ir@Cu/Zn-MOF probe for bacterial lateral flow immunoassay and precise synergistic antibacterial treatment.Biosensors & bioelectronics,224, 115033.