【引言】

　　食品或飼料中的霉菌毒素污染對(duì)人類和動(dòng)物健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)后果。在真菌毒素中，黃曲霉毒素是人類和動(dòng)物健康中最引人關(guān)注的問題。事實(shí)上，黃曲霉毒素被認(rèn)為已知致突變和致癌作用最強(qiáng)的物質(zhì)之一。全球一些國(guó)家和國(guó)際當(dāng)局為控制黃曲霉毒素以及其他主要真菌毒素制定了嚴(yán)格的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，以限制這些毒素的攝入。

　　雖然色譜技術(shù)，例如高效液相色譜(HPLC)與熒光檢測(cè)或質(zhì)譜相結(jié)合，可以提供真菌毒素的準(zhǔn)確鑒定。然而，因霉菌毒素暴露、監(jiān)測(cè)工具資源匱乏而真正有健康負(fù)擔(dān)的廣大發(fā)展中國(guó)家卻缺乏一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)的檢測(cè)方法。為滿足一系列分析要求，基于競(jìng)爭(zhēng)性免疫原理測(cè)定黃曲霉毒素的大量檢測(cè)方法已經(jīng)開發(fā)出來。然而，與競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析相比，非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定法靈敏度更高、動(dòng)態(tài)范圍更寬、精度更高、孵育時(shí)間更短，因此將是檢測(cè)微量小分子的理想方法。

　　抗體工程領(lǐng)域的巨大進(jìn)步帶來了非常規(guī)抗體結(jié)合物的發(fā)現(xiàn)，使得小分子的非競(jìng)爭(zhēng)性分析得以發(fā)展。作者基于抗免疫復(fù)合物(anti-IC)抗體其體積小的優(yōu)點(diǎn)來解決小分子夾心法的空間位阻問題，同時(shí)通過噬菌體展示技術(shù)可控地、有目的地制備抗免疫復(fù)合物抗體。

　　【內(nèi)容介紹】

　　作者的實(shí)驗(yàn)思路為：首先制備抗抗原抗體復(fù)合物(IC：immunocomplex)結(jié)合物(scFv- AP)，它們由抗IC的scFv與細(xì)菌堿性磷酸酶(AP)融合組成。作者從合成單價(jià)scFv文庫中找出抗IC抗體序列，通過噬菌體展示技術(shù)制備了與細(xì)菌堿性磷酸酶融合的單個(gè)scFv結(jié)合物。其次使用抗AFB1抗體和固定在磁珠上的AFB1作為靶標(biāo)物開始連續(xù)篩選。作者首先將抗IC結(jié)合物先加入到抗AFB1和非特異性可溶性小鼠IgG中來剔除非特異性結(jié)合的抗IC結(jié)合物。之后將生物素化的抗AFB1抗體固定在鏈霉親和素包被的磁珠表面，并用AFB1飽和，來篩選可以結(jié)合靶標(biāo)的抗IC結(jié)合物(圖1)。在第三輪中，將抗AFB1直接偶聯(lián)到同樣被AFB1飽和的環(huán)氧涂層磁珠上，來避免結(jié)合物富集于鏈霉親和素或生物素。作者共篩選了320個(gè)抗IC結(jié)合物，在測(cè)試的結(jié)合物中，只有18種結(jié)合物具有特異性。從這些序列中，鑒定出12個(gè)獨(dú)特的DNA序列，克隆4H2在試驗(yàn)中表現(xiàn)出最高的信號(hào)與背景比(存在或不存在AFB1)，即最優(yōu)秀的檢測(cè)性能。

　　圖1篩選示意圖

　　大規(guī)模生產(chǎn)、純化4H2抗IC結(jié)合物后，作者用不同黃曲霉毒素(AFB1,AFB2, AFG1, AFG2, AFM1)對(duì)所鑒定的抗IC結(jié)合物進(jìn)行性能測(cè)試，研究其特異性。數(shù)據(jù)表明其與黃曲霉毒素B2和G1具有顯著的交叉反應(yīng)性，可用于接下來的免疫測(cè)定。作者將生物素化的抗AFB1抗體固定在鏈霉親和素包被的微孔板上，抗AFB1抗體與目標(biāo)分析物AFB1形成的免疫復(fù)合物被抗IC結(jié)合物識(shí)別，該結(jié)合物進(jìn)一步被放射銪元素標(biāo)記的抗AP抗體識(shí)別。實(shí)驗(yàn)試劑共同孵育，沖洗后，加入銪熒光增強(qiáng)劑(EFI)溶液后測(cè)量時(shí)間分辨熒光信號(hào)(圖2)。

　　圖2實(shí)驗(yàn)方法示意圖

　　作者優(yōu)化了兩種免疫復(fù)合物中參與的抗體的量，雖然較高的抗體濃度增加了檢測(cè)絕對(duì)信號(hào)，但EC50值的檢測(cè)靈敏度并沒有隨著抗體濃度的增加而進(jìn)一步提高。反而較低的抗體濃度可以提供更好的檢測(cè)限，因?yàn)闆]有AFB1時(shí)的背景信號(hào)和標(biāo)準(zhǔn)偏差較低。此外，作者還考察了孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)性能的影響。隨著孵育時(shí)間的增加，絕對(duì)熒光信號(hào)有一定程度的增加。然而，較長(zhǎng)的孵育時(shí)間并沒有顯著提高檢測(cè)靈敏度，不同孵育時(shí)間獲得的EC50值相似。

　　最終，測(cè)量的時(shí)間分辨熒光信號(hào)用空白信號(hào)+ 3 ×空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算所得，該試驗(yàn)靈敏度為70 pg mL-1(0.22 nM)?？紤]到實(shí)驗(yàn)分析樣品提取時(shí)使用的10倍稀釋系數(shù)，該LOD對(duì)應(yīng)于食品樣品中的黃曲霉毒素含量為3.5µg kg-1(圖3)?，F(xiàn)行的歐盟委員會(huì)法規(guī)對(duì)黃曲霉毒素的總量根據(jù)所涉及的食品的不同而變化，從4到10µg kg-1。這種新型免疫分析法的靈敏度與以前報(bào)道的黃曲霉毒素免疫分析法相當(dāng)，但作者的方法有簡(jiǎn)單快速的分析優(yōu)勢(shì)。

　　圖3克隆4H2一步檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量的時(shí)間分辨熒光信號(hào)用三個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。EC50值由四參數(shù)logistic擬合確定，檢出限(LOD)計(jì)算為空白信號(hào)+ 3 ×空白標(biāo)準(zhǔn)差。

　　作者對(duì)非競(jìng)爭(zhēng)性抗IC免疫測(cè)定法對(duì)實(shí)際樣品基質(zhì)的適用性通過加標(biāo)食品樣品得到了驗(yàn)證。用高效液相色譜法對(duì)同一加標(biāo)樣品進(jìn)行驗(yàn)證分析，通過測(cè)定加標(biāo)玉米、水稻和榛子樣品中AFB1的濃度來評(píng)價(jià)該方法的性能?；厥章蕿?3% ~ 129%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1 ~ 4%，證明了非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析法在樣品分析中的適用性。

　　【結(jié)論】

　　最終，作者證明了噬菌體展示抗體文庫技術(shù)在開發(fā)針對(duì)困難靶標(biāo)(如免疫復(fù)合物)的結(jié)合物方面的有效性。在抗IC抗體和單克隆捕獲抗體的基礎(chǔ)上，利用銪標(biāo)記的二抗建立了一種非競(jìng)爭(zhēng)性一步免疫測(cè)定方法。該方法具有良好的分析性能，且簡(jiǎn)便而使用成本低廉，為黃曲霉毒素篩選提供了一種實(shí)用的方法，并證明了一步非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定法分析小分子污染物的潛力。

　　原文出處linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814622012493

　　指導(dǎo)老師：王戰(zhàn)輝
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